جيل ووسمها الفئران خلايا نخاع العظام المستمدة من البلورات النانوية مع شجيري Qdot تتبع للدراسات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير الخلايا الشجيرية لدراسات التصوير باستخدام بلورات Q dot النانوية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل خلايا نخاع العظم من العظم القص وعظام الفخذ وعظام الظنبوب. بعد ذلك، يتم إعداد مستنبتات لخلايا نخاع العظم لتسهيل تمايز الخلايا إلى خلايا شجيرية في وجود GM CSF.

بعد ذلك، يتم استعادة الخلايا الشجرية من مزارع خلايا نخاع العظم بعد ثمانية أيام. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في صبغ الخلايا ببلورات Q النانوية الفلورية. وفي النهاية، يمكن رؤية الخلايا الشجرية المصبوغة بوضوح باستخدام المجهر الفلوري.

تتمثل الميزة الرئيسية لاستخدام هذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى، مثل استخدام الخلايا التغصنية الموسومة ببروتين GFP، في أن بلورات النقاط الكمومية (Q dot) النانوية تحتفظ بفلوريتها حتى بعد الصبغ باستخدام المذيبات العضوية مثل الأسيتون. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية لعلماء بيولوجيا الخلايا التغصنية، مثل خصائص هجرة هذه الخلايا في أمراض مختلفة أو في سياق أمراض متباينة. وستقوم ماريا علي، طالبة دراسات عليا من مختبري، بتوضيح إجراءات الصبغ.

بعد عملية التضحية، قم بتشريح عظم الظنبوب وعظام الفخذ بعناية من فأرين دون قطع أطراف العظام. ثم استخدم المناديل الورقية لتنظيف جميع الأنسجة الملتصقة بالعظام، مع الحرص على عدم كسرها. يتم ذلك داخل غطاء السلامة البيولوجية.

املأ طبق بتري بقطر 35 مليمتر بـ 70%ethanol، ثم اغمر العظام في الـ ethanol لمدة 10 دقائق. بعد تعقيم العظام، استخرجها من الـ ethanol واتركها تجف في الهواء لمدة خمس دقائق في طبق بتري جديد. الآن، اقطع عظمة الفخذ من المنتصف وعظمة الظنبوب من أنحف طرف لها.

قم بحقن الأجزاء الداخلية من العظام بـ 1 mL من وسط RPMI باستخدام حقنة معقمة. اجمع معلق الخلايا في أنبوب سعة 15 mL واغسله مرتين باستخدام وسط RPMI عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق بسرعة 300 ×g عند درجة حرارة 4 °C في جهاز طرد مركزي مزود بدوار ذي سلال متأرجحة. بعد الغسلة الأخيرة، أعد تعليق الخلايا في 2 mL من منظم CK lysis، واحضنها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة للتخلص من خلايا الدم الحمراء.

بعد ذلك، أضف 13 milliliters من RPMI مضافاً إليها 10%FBS واغسل الخلايا مرتين إضافيتين في هذا الوسط باستخدام نفس إعدادات جهاز الطرد المركزي السابقة. قم بعدّ الخلايا وضبط التركيز ليصبح 2 × 10⁵ خلية لكل milliliter. وباستخدام RPMI مضافاً إليها 10%FBS، أضف recombinant murine G-M-C-S-F ليصل التركيز النهائي إلى 20 nanograms لكل milliliter.

بعد ذلك، أضف 10 milliliters من هذا المعلق إلى طبق بتري بقطر 10 centimeter معقم وبجودة ميكروبيولوجية وازرعه. يتم وضع معلق الخلايا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. وبعد مرور ثلاثة أيام، أضف 10 milliliters أخرى من وسط RPMI مضافاً إليه 10%FBS مع 20 nanograms per milliliter من recombinant murine G-M-C-S-F إلى كل طبق من الأطباق المجهزة.

بعد مرور ثلاثة أيام أخرى، يتم استعادة 10 milliliters من معلق الخلايا من كل طبق بتري، وتُفصل الخلايا باستخدام جهاز الطرد المركزي تحت نفس الظروف، ثم يُعاد تعليق الراسب في نفس الحجم من وسط RPMI مضافاً إليه 10%FBS كما تم استعادته من أطباق بتري، ويُستكمل بإضافة عامل G-M-C-S-F الفأري المؤتلف الجديد. وأخيراً، يُعاد معلق الخلايا إلى كل طبق بتري أصلي وتُزرع الخلايا لمدة يومين إضافيين في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. وبعد ثمانية أيام من الزراعة، يتم استعادة الخلايا العائمة والخلايا ضعيفة الالتصاق عن طريق غسل أطباق بتري بوسط غذائي جديد.

بعد ذلك، يتم وسم الخلايا التي تم جمعها باستخدام طقم وسم الخلايا Q tracker 6 55 مع اتباع تعليمات الشركة المصنعة بدقة لوسم 5×10⁶ من الخلايا التغصنية (DCs) المشتقة من نخاع العظم للفئران باستخدام بلورات Q nano بتركيز 10 nM. أولاً، اخلط 5 µL من كل من مكوني الطقم A و B في أنبوب إبندورف، واترك الخليط ليرقد لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 1 mL من وسط RPMI مضافاً إليه 10% FBS، وقم برج الأنبوب باستخدام جهاز الفورتكس لمدة 30 ثانية.

بعد ذلك، أضف 5 × 10⁵ من خلايا Dcs المعلقة في 0.5 milliliters من وسط RPMI مضافاً إليه 10%FBS إلى أنبوب einor، واحضن الخلايا في محلول D عند درجة حرارة 37 درجة Celsius لمدة 60 دقيقة. ثم اغسل الخلايا مرتين في وسط RPMI مضافاً إليه 10%FBS تحت نفس الظروف السابقة، وأعد تعليق الراسب في وسط RPMI.

يوضح هذا الشكل مثالاً لصورة مجهرية فلورية لـ dcs. مباشرة بعد عملية الوسم، تم وضع قطرة من الخلايا الموصومة على شريحة زجاجية وتغطيتها بغطاء شريحة. بعد ذلك، تم تقييم العينات باستخدام مجهر فلوري.

في هذا الشكل، يمكن رؤية صورة مجهرية فلورية لخلايا dcs بعد 48 ساعة من النضج في المختبر مع وجود علامات توضيحية. تم استزراع خلايا dcs لمدة 48 ساعة مع 100 nanograms per milliliter من LPS و 20 nanograms per milliliter من TNF alpha في غرف استزراع شرائحية داخل حضانة ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك، غُسلت العينات بمحلول PBS وثُبّتت باستخدام الأسيتون، ثم صُبغت صبغة تباينية باستخدام DPI وقُيمت باستخدام المجهر الفلوري.

تم تحليل الخلايا التغصنية (dcs) المميّزة والتي نضجت في المختبر باستخدام قياس التدفق الخلوي، حيث تعطي الخلايا المصبوغة بـ Q dot إشارة قوية في قناة FL three، مقارنة بالخلايا المصبوغة بـ Q do وغير المصبوغة. كما صُبغت الخلايا التغصنية إضافياً بأجسام مضادة محددة ضد علامات النضج، CD 86 وCD 40، وعناصر تحكم من النوع المتماثل (isotype controls)، ثم حُللت الخلايا بواسطة قياس التدفق الخلوي. بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد مستويات IL six وأكسيد النيتريك في المادة الطافية للخلايا التغصنية الناضجة المصبوغة بـ Q stain ومجموعات التحكم.

يظهر هنا شكل تمثيلي لخلايا DCS الموّسمة في نسيج مُشرح. تم حقن خلايا dcs الناضجة وريدياً في فئران C 57 black six. وبعد ثلاثة أيام، تم التضحية بالفئران وجمع الطحال.

تم التجميد السريع للعينات وتضمينها في مركب OCT، ثم جُهزت مقاطع بسمك ثمانية ميكرون باستخدام المبرد (cryostat). بعد ذلك، تم تثبيت العينات باستخدام الأسيتون، وصبغها صبغة تباينية بـ DPI، وتقييمها باستخدام مجهر فلوري. وذلك باتباع هذه الإجراءات.

يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل عرض المستضد أو الإنضاج باستخدام محفزات مختلفة للإجابة على تساؤلات إضافية، مثل هجرة الخلايا التغصنية استجابةً لمحفزات إنضاج مختلفة.