جيل ووسمها الفئران خلايا نخاع العظام المستمدة من البلورات النانوية مع شجيري Qdot تتبع للدراسات

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد الخلايا المتغصنة لدراسات التصوير باستخدام بلورات النانو Q dot. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل خلايا نخاع العظم أولا عن الفخذ وعظم الفخذ والظنبوب. بعد ذلك ، يتم إعداد مزارع خلايا نخاع العظم لتسهيل تمايز الخلايا إلى خلايا متغصنة في وجود السائل الدماغي النخاعي المعدلة وراثيا.

ثم يتم استرداد الخلايا المتغصنة من مزارع خلايا نخاع العظم بعد ثمانية أيام. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي تلطيخ الخلايا ببلورات نانو Q الفلورية. في النهاية ، يمكن تصور الخلايا المتغصنة الملطخة بألوان زاهية عن طريق الفحص المجهري الفلوري.

الميزة الرئيسية لاستخدام هذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى مثل استخدام الخلايا المتغصنة لعلامة GFP ، هي أن بلورات النانو Q dot تحتفظ بتضانها حتى بعد تلطيخها بالمذيبات العضوية مثل الأسيتون. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علماء أحياء الخلايا المتغصنة ، مثل خصائص هجرة هذه الخلايا في أمراض مختلفة أو في سياق أمراض مختلفة. ستظهر عملية التلوين ماريا علي ، طالبة دراسات عليا من مختبري.

بعد التضحية ، قم بتشريح الساق وعظم الفخذ بعناية من فأرين دون قطع نهايات العظام. ثم استخدم المناديل الورقية لتنظيف جميع الأنسجة المرفقة من العظام ، مع الحرص على عدم كسرها. في غطاء السلامة البيولوجية.

املأ طبق بتري 35 ملم بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم اغمر العظام في الإيثانول لمدة 10 دقائق. بعد تعقيم العظام ، استرجعها من الإيثانول واتركها تجف في الهواء لمدة خمس دقائق في طبق بتري جديد. الآن ، قم بقص عظم الفخذ في المنتصف والساق بأنحف طرفها.

انقع الدواخل من العظام بملليلتر واحد من وسط RPMI باستخدام حقنة معقمة. اجمع معلق الخلية في أنبوب سعة 15 مليلتر واغسله مرتين بوسيط RPMI بواسطة طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 300 مرة G عند أربع درجات مئوية في جهاز طرد مركزي باستخدام دوار دلو متأرجح. بعد الغسيل الأخير ، يعلق المجدد الخلايا في ملليلترين من تحلل CK ، واحتضان لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة من أجل القضاء على خلايا الدم الحمراء.

بعد ذلك ، أضف 13 مل من RPMI بالإضافة إلى 10٪ FBS واغسل الخلايا مرتين أخريين في هذا الوسيط بنفس إعدادات أجهزة الطرد المركزي كما كان من قبل. عد الخلايا واضبط التركيز إلى اثنين في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر. مع RPMI بالإضافة إلى 10٪ FBS ، أضف الفئران المؤتلف G-M-C-S-F إلى التركيز النهائي البالغ 20 نانوغرام لكل ملليلتر.

ثم أضف 10 ملليلتر من هذا التعليق إلى طبق وثقافة بتري بتري بجودة ميكروبيولوجية معقمة 10 سم. تعليق الخلية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. بعد ثلاثة أيام ، أضف 10 ملليلتر أخرى من RPMI بالإضافة إلى 10٪ FBS مع 20 نانوغرام لكل ملليلتر من الفئران المؤتلفة G-M-C-S-F إلى كل لوحة من الألواح المعدة.

بعد ثلاثة أيام أخرى ، استرجع 10 ملليلتر من تعليق الخلية من كل طبق بتري ، وقم بالطرد المركزي للخلايا في نفس الظروف وأعد تعليق الحبيبات بنفس حجم RPMI بالإضافة إلى 10٪ FBS كما تم استردادها من أطباق Petri وتجديدها بالفئران المؤتلف الجديد G-M-C-S-F. أخيرا ، أعد معلق الخلية إلى كل طبق بتري أصلي وقم بزراعة الخلايا لمدة يومين إضافيين في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. بعد ثمانية أيام في الثقافة ، استرجع الخلايا العائمة والملتصقة بشكل فضفاض عن طريق غسل أطباق بتري بوسط طازج.

ثم قم بتسمية الخلايا التي تم جمعها باستخدام مجموعة وضع العلامات على الخلايا Q tracker 6 55 بدقة باتباع تعليمات الشركة المصنعة لتسمية خمسة أضعاف 10 إلى سادس من نخاع عظم الفئران المشتق dcs ببلورات Q nano بتركيز 10 نانو مولار. قم أولا بخلط خمسة ميكرولترات من كل مكون من مكونات المجموعة A و B في أنبوب einor ، واحتضن الخليط لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف ملليلترا واحدا من RPMI بالإضافة إلى 10٪ FBS ، وقم بتدوير الأنبوب لمدة 30 ثانية.

بعد ذلك ، أضف خمسة في 10 إلى الخامس. يتم تعليق Dcs في 0.5 مل من RPMI بالإضافة إلى 10٪ FBS إلى أنبوب einor واحتضان الخلايا في المحلول D عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. ثم اغسل الخلايا مرتين في RPMI بالإضافة إلى 10٪ FBS في نفس الظروف كما كان من قبل ، وأعد تعليق الحبيبات في RPMI.

يوضح هذا الشكل مثالا على صورة صغيرة فلورية ل dcs. مباشرة بعد وضع العلامات ، تم ترسيب قطرة من الخلايا المصنفة على شريحة زجاجية ومغطاة بقلة غطاء. ثم تم تقييم العينات باستخدام المجهر الفلوري.

في هذا الشكل ، يمكن رؤية صورة ميكرو فلورية ل dcs بعد 48 ساعة ، يمكن رؤية النضج في المختبر مكتوبة. تم استزراع Dcs لمدة 48 ساعة ب 100 نانوجرام لكل مليلتر ، LPS و 20 نانوجرام لكل مليلتر ، TNF alpha على غرف استزراع منزلق في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. ثم تم غسل العينات باستخدام PBS المثبت بالأسيتون ، وصبغ مضاد باستخدام DPI وتقييمها باستخدام مجهر الفلورسنت.

تم تحليل dcs المسمى الناضجة في المختبر عن طريق قياس التدفق الخلوي ، وتعطي الخلايا الملونة Q إشارة قوية في FL ، وثلاث قنوات Q ملطخة وغير ملطخة. بالإضافة إلى ذلك ، تم تلطيخ الخلايا البينية بأجسام مضادة محددة ضد علامات النضج ، CD 86 و CD 40 ، ثم تم تحليل خلايا التحكم في النمط المتماثل عن طريق قياس التدفق الخلوي. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد مستويات IL ستة وأكسيد النيتريك في المواد الطافية ل DCS وعناصر التحكم الناضجة Q stain.

هنا يظهر شكل تمثيلي ل DCS المسمى في نسيج تشريح مسمى. تم حقن dcs الناضجة عن طريق الوريد في C 57 ستة فئران سوداء. بعد ثلاثة أيام ، تم التضحية بالفئران وجمع الطحال.

تحضير Snap المجمدة المضمنة في OCT وثمانية أقسام ميكرون باستخدام CRYOSTAT. ثم تم إصلاح العينات باستخدام الأسيتون ، وصبغ مضاد باستخدام DPI ، وتقييمها باستخدام مجهر الفلورسنت. اتباع هذه الإجراءات.

يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل وضع المستضد أو النضج بمحفزات مختلفة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل هجرة الخلايا المتغصنة استجابة لمحفزات النضج المختلفة.