توليد عدد كبير من فروعه النقوي وسلائف الخلايا الجذعية من نخاع العظام مورين باستخدام خلية رواية فرز استراتيجية

يمكن أن تمكن هذه الطريقة الباحثين من الحصول على أعداد كافية من أنواع الخلايا للإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة التنموي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تعتمد على عدد قليل من العلامات المختارة لعزل أعداد كبيرة من الخلايا الموجودة تقليديا بأعداد منخفضة خارج الجسم الحي. يمتد تأثير هذه التقنية إلى زراعة نخاع العظم العلاجي ، لأنها تسمح بعزل أعداد كبيرة من الأسلاف.

لبدء البروتوكول ، قم بتشبع الأرجل الخلفية وجذع الفأر المعد مسبقا بنسبة 75٪ من الإيثانول ، وقم بعمل جروح ضحلة عبر الجلد حول مفصل الورك باستخدام مقص الأنسجة المنحني. ثم قم بإزالة وتجريد الأرجل الخلفيتية. باستخدام الملقط ، اسحب الجلد بقوة من الورك لأسفل باتجاه الكاحل ، وكشف العضلات ، واستخدم المقص لإزالة سديلة الجلد.

اقطع فوق عظم الفخذ ومفصل الورك مباشرة ، وقم بإزالة الساق الخلفية بالكامل عن طريق قطع العظم. العمل في خزانة السلامة الحيوية المعقمة ، انقل الأرجل إلى أحد أطباق بتري المعدة مسبقا. استخدم المقص لقطع أسفل الكاحل مباشرة ، وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من العضلات والنسيج الضام المرن بعناية.

انقل العظم النظيف إلى طبق بتري الثاني المعد. بعد ذلك ، افصل عظم الفخذ والركبة والساق. باستخدام الملقط ، أمسك الساق عند الركبة وحدد موقع النخاع ، وهو خط أحمر باهت داخل تجويف العظام في الجزء العلوي من عظم الفخذ ونحو نهاية الساق.

باستخدام المقص ، اقطع الساق فوق المكان الذي يبدو أن النخاع ينتهي فيه. قطع أسفل مفصل الركبة مباشرة ، وقطع فوق مفصل الركبة مباشرة. ثم اغسل نخاع العظم من عظم الفخذ والساق.

املأ حقنة سعة 10 مليلتر بوسائط كاملة من الأنبوب المخروطي سعة 50 مليلتر ، وقم بتغطية المحقنة بإبرة قياس 23. أمسك العظم بالملقط فوق طبق بتري الثالث المحضر ، وأدخل الإبرة في قناة العظام ، وادفع الوسائط من خلالها ، وطرد الخلايا. كرر هذه الخطوة حتى لا يمكن رؤية المزيد من اللون من خلال العظام.

استمر في الإجراء عن طريق سحق المشاشية. بينما لا تزال في طبق بتري الثاني ، أمسك الرضفة بإحكام بالملقط ، واهرس الركبتين بطرف المحقنة. استمر حتى تختفي المشاشية باللون الأحمر.

باستخدام المحقنة ، انقل الخلايا من أطباق بتري الثانية والثالثة إلى أنبوب 50 ملليلترا. قم بتفتيت الكتل عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل ، وحاول تجنب تكوين الفقاعات. الطرد المركزي الخلايا.

ثم قم بإزالة المادة الطافية باستخدام الماصة المصلية ، وقم بإزاحة الحبيبات عن طريق النقر ، وقم بتحلل خلايا الدم الحمراء عن طريق احتضانها في ملليلتر واحد من كلوريد الأمونيوم والبوتاسيوم أو محلول تحلل ACK ، لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. باستخدام ماصة مصلية ، أضف 40 مل من المخزن المؤقت HBSS. باستخدام ماصة مصلية ، قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مليلتر ، وقم بالطرد المركزي للخلايا.

باستخدام ماصة مصلية ، قم بإزالة المادة الطافية وزراعة خلايا نخاع العظم في وسائط كاملة مع 10 نانوغرام لكل مليلتر من الفأر المؤتلف GM-CSF بكثافة واحدة في 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر. باستخدام ماصة مصلية ، انقل الخلايا إلى ألواح زراعة الأنسجة ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، حتى تصبح جاهزة للمضي قدما في التلوين. برفق ، ولكن بدقة ، قم بعمل ماصة الخلايا لأعلى ولأسفل لإخراج الخلايا الملتصقة بشكل فضفاض.

باستخدام ماصة مصلية ، انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر ، وقم بالطرد المركزي للخلايا. اسكب المادة الطافية برفق ، واغسل الخلايا المحببة بإضافة 30 مل من محلول غسيل FACS ، أو SFWB ، باستخدام الماصة المصلية. ثم الطرد المركزي للخلايا وكرر الغسيل.

بعد ذلك ، قم بتعليق الخلايا وصخها وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للجسم المضاد. أعد تعليق خمس مرات 10 إلى الخلايا السابعة في مليلتر واحد من FWB ، وأضف ميكروغرامين لكل من مضاد Ly-6C ، ومضاد CD115 ، المسمى بالفلوروفور. لمزيد من التمييز بين CMP و MODC ، أضف ميكروغرامين من الأجسام المضادة ل CD11C.

احتضان العينات لمدة 30 دقيقة على الثلج. بعد الحضانة ، استخدم ماصة مصلية لإضافة 10 مل من FWB ، وقم بالطرد المركزي للخلايا. اسكب المادة الطافية برفق ، واغسل الخلايا المحببة بإضافة 30 مل من FWB بماصة مصلية.

الطرد المركزي للخلايا ، وكرر الغسيل. قبل تعليق الخلايا ، قم بنفض الغبار عن الأنبوب جيدا لإخراج الحبيبات. استخدم ماصة مصلية لإعادة تعليق الخلايا مرة واحدة من 10 إلى 7 خلايا لكل مليلتر من FWB ، وقم بترشيحها من خلال مرشح خلية 35 ميكرومتر.

استخدم ماصة مصلية لنقل الخلايا المفلترة إلى أنبوب بولي بروبيلين ، وضع الأنبوب على الجليد حتى تصبح جاهزة للفرز. قم بتشغيل عنصر التحكم غير الملوثة من خلال فارز الخلايا ، وقم بتطبيق بوابة لاستبعاد الحطام الصغير والجزيئات عالية الحبيبات. قم بتشغيل عينات التحكم الفلورية المفردة من خلال فارز الخلايا ، واضبط التعويض حسب الحاجة.

قم بتشغيل عينة من العينة متعددة التسميات، ولاحظ أربعة مجموعات سكانية متميزة. ضع بوابة لعزل كل من المجموعات السكانية الأربعة الرئيسية. قم بإعداد أنابيب التجميع عن طريق إضافة ما يكفي من مصل ربلة الساق الجنينية ، أو FCS ، لتحقيق تركيز نهائي بنسبة 20٪ على الأقل عند الامتلاء.

على سبيل المثال ، إذا كنت تستخدم خمسة أنابيب مليلتر ، أضف ملليلترا واحدا من FCS قبل الفرز ، وقم بإزالة الأنبوب عندما يصل إلى الحجم الإجمالي خمسة ملليلتر. لمنع دوران الغشاء وامتصاص الأجسام المضادة ، احتفظ بجميع العينات عند أربع درجات مئوية طوال فترة الفرز. بعد جمع العدد المطلوب من الخلايا ، استخدم ماصة مصلية لنقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي جديد ، وقم بالطرد المركزي للخلايا.

قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من FWB ، وقم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى. كرر تعليق FWB لمدة غسلتين. أخيرا ، قم بإزالة المادة الطافية بعد الغسيل الثاني ، واستمر بناء على تصميم التجربة.

للحفاظ على أكبر عدد ممكن من القنوات المتاحة للتحليل ، تم اختيار الخلايا القابلة للحياة بشكل روتيني ، بناء على التشتت الأمامي والجانبي ، باستثناء الأحداث الصغيرة جدا والدقيقة جدا. لتحديد ما إذا كانت استراتيجية البوابات هذه تستبعد الخلايا الميتة بشكل موثوق ، تم تلطيخ العينات ب 7-Aminoactinomycin D.Cells التي تم تحليلها مباشرة بعد الحصاد تحتوي على ما يقرب من 10٪ من الخلايا الإيجابية 7-AAD ، عندما تم تطبيق بوابة FSC و SSC النموذجية على الخلايا المعزولة حديثا من نخاع العظام. كانت نسبة مماثلة من الخلايا الميتة موجودة أيضا في الإقامة 1 والبقاء 3 من الثقافة.

بحلول اليوم الخامس ، تم تقليل عدد الخلايا الميتة داخل البوابة إلى 5٪ ، وبالتالي ، فإن استخدام بوابة البقاء هذه مناسب بشكل عام للفرز في اليوم الخامس وما بعده. كشف قياس التدفق الخلوي أنه ضمن Ly6C السلبي ، استمرت الخلايا الإيجابية CD115 و CD3 و CD45R بقوة خلال اليوم من الصفر إلى الثالث. في اليوم الرابع ، لم يتبق سوى عدد قليل من الخلايا الإيجابية CD3 و CD45R ، وبحلول اليومين الخامس والسادس ، لم تكن هناك خلايا معبرة عن CD3 و CD45R. وهكذا ، في غضون أربعة أيام من الزراعة في GM-CSF ، كانت الخلايا الإيجابية للنسب غائبة بشكل أساسي ، ولم يتم اكتشافها على الإطلاق في اليومين الخامس والسادس من الثقافة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن التركيب الخلوي يعتمد على طول الثقافة. ينتج عن الفرز بعد ثلاثة أيام من الحصاد أعداد كبيرة من المراحل المبكرة وعدد قليل من المراحل المتأخرة ، والعكس صحيح بالنسبة للمزارع التي تم فرزها بعد خمسة أيام.