تحليل فسيفساء من وظائف الجينات في الدماغ بعد الولادة ماوس التنمية عن طريق استخدام فيروس لجنة المساواة العرقية القائمة على التوحد
أغسطس 1, 2011
و في الجسم الحي طريقة لاختبار وظيفة الجين في الدماغ بعد الولادة. يتم حقن AAVs المؤتلف معربا عن لجنة المساواة العرقية و / أو بروتين فلوري في مخ الفأر الولدان. وتتحقق الفسيفساء تعطيل الجينات ووضع العلامات العصبية متناثر ، مما يسمح التحليل السريع وظيفة الجين في العمليات الحرجة للتنمية الدوائر العصبية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو التلاعب بوظيفة الجينات خلال فترة ما بعد الولادة من نمو الدماغ. يتم تحقيق ذلك عن طريق اختيار الفيروسات المناسبة أولا وإعدادها ، وتحميلها في المحقنة وإعداد معدات الحقن. ثم يتم حقن الفيروس في أدمغة صغار الفئران حديثي الولادة ، والخطوة الأخيرة هي التضحية بالحيوانات وتصوير المناطق المحقونة.
في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر وضع العلامات التفاضلية لخلايا التحكم والضربة القاضية من خلال الفحص المجهري المناعي الفلوري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل كيفية تنظيم فترة تطور ما بعد الولادة وراثيا. للحقن ، يمكن استخدام محلول الفيروس المرتبط بالغدة المتاح تجاريا بالعيار الكامل ، عادة من 10 إلى 12 ، نسخ الجينوم لكل مليلتر لمعالجة عدد كبير من الخلايا.
إذا كانت هناك رغبة في وضع العلامات أو الملصقات ، فابدأ بتخفيف من واحد إلى 10. بعد إذابة الفيروس على الجليد ، انقل على الفور حجم التخفيف المسبق إلى أنبوب PCR معقم سعة 250 ميكرولتر. حافظ على التخفيف على الجليد. الآن.
قم بإعداد مضخة الحقن عن طريق اختيار حقنة مناسبة وتوصيلها بإبرة تحميل. بعد ذلك ، ارسم محلول الفيروس برفق حتى تظهر فقاعة هواء صغيرة جدا في المحقنة ويمكن استخدام صبغة التحميل الخاملة لتسهيل هذه الخطوة. الآن قم بتثبيت المحقنة في المضخة باستخدام التجنيب.
ثم قم بتوصيل الأنابيب الضامة برفق بين المحقنة وحامل الإبرة. تأكد من أن إبرة الحقن على اتصال مباشر بالأنبوب الضام داخل حامل الإبرة. الآن ، حرك المحلول ببطء عبر الأنبوب الضام حتى تظهر قطرة صغيرة من المحلول عند طرف الإبرة.
قم بتأمين المكبس بعناية بجوار كتلة الدفع بقوس على المضخة. اضبط معدل الحقن على ثمانية ميكرولتر في الدقيقة واضبط حجم الحقن على ما بين ميكرولتر وميكرولتر. ثم اضبط إعداد قطر حقنة المضخات لتتناسب مع قطر المحقنة التي تستخدمها.
أخيرا ، لحماية الجراء أثناء مرحلة التعافي ، اضبط الصفيحة الساخنة على 38 درجة مئوية وقم بتغطيتها بمنشفة ورقية. باستخدام بروتوكول معتمد من IACUC ، قم بإعداد صغار الفأر P صفر أو P واحد للحقن عن طريق إخضاعهم للتخدير البارد. بلل بعض المناشف الورقية بالماء وضعها على الثلج.
ثم ضع أربعة أو خمسة صغار على منشفة ورقية مفصولة جيدا. قم بطي المناشف الورقية فوق الجراء ، ضع برفق كمية صغيرة من الثلج المجروش فوق المناشف الورقية واحتضن الجراء لمدة خمس دقائق تقريبا. يمكن الاحتفاظ بالجراء بأمان على الجليد لمدة تصل إلى 15 دقيقة ولا يزال يتعافى بشكل جيد.
الآن ضع جروا مخدر على كتلة تثبيت للحصول على أفضل وصول إلى موقع الحقن. يمكن الوصول إلى القشرة ، على سبيل المثال ، بسهولة أكبر عن طريق وضع بشكل مسطح على بطنه. يمكن تثبيت الجرو في مكانه باستخدام ضمادة ، وتثبيت رأس الجرو يدويا وسحب الجلد بإحكام لمنعه من الحركة.
ثم انتقل إلى المعالم التشريحية للجمجمة مثل خياطة لامدا ، وحدد نقطة حقن قابلة للتكرار باليد الأخرى ، وأدخل الإبرة برفق من خلال الجمجمة. لا تضغط بقوة إذا لم تخترق الإبرة الجمجمة بسهولة. بدلا من ذلك ، أعد وضع الإبرة وحاول برفق مرة أخرى.
يختلف عمق الحقن قليلا بين الفردية والسلالات في القشرة ، وعادة ما يعمل عمق نصف إلى ملليمتر واحد. الآن ، قم بحقن محلول الفيروس عن طريق جعل أحد الزملاء ينشط المضخة لتقليل حركات اليد. من الناحية المثالية ، يمكن استخدام دواسة القدم لبدء تشغيل المضخة بعد الحقن.
احتفظ بالإبرة في مكانها لبضع ثوان ، ثم حافظ على رأس الجرو بسلاسة. حرك الإبرة للخارج. الآن ، اسمح للجرو بالتعافي لمدة خمس إلى 10 دقائق على اللوحة الساخنة المغطاة.
خلال هذا الوقت ، استمر في حقن الجراء الأخرى. عندما يستعيد الجراء لونهم الوردي ويتحركون جميعا ، افركهم برفق بجزء من فراش منزلهم. عندها فقط يمكن إعادتهم إلى والدتهم.
خلاف ذلك ، يمكن معاملتهم على أنهم صغار غير مألوفة ، والتي من المرجح أن تقتلها الأم بعد إعادة الجراء إلى والدتهم. قم بتنظيف إعداد الحقن عن طريق تحميل المحقنة بالكامل بالأسيتون أو 70٪ الإيثانول. إذا كانت المكونات الحساسة للأسيتون مثل السانو والمواد اللاصقة قيد الاستخدام ، فقم بغسل المحلول من خلال إعداد الحقن عدة مرات باستخدام محلول جديد في كل مرة.
سيؤدي ذلك إلى إزالة أي محلول فيروسي متبقي ويترسب المذيبات. بعد التخلص من الإعداد ، قم بتطهير منطقة عمل المبيض لتركها جاهزة للمجرب التالي. معلمه. تنتج التقنية الناجحة عدوى عصبية قوية في موقع الحقن.
عادة ما تؤدي الحقن في مناطق محددة مثل القشرة والقولون العلوي إلى حدوث عدوى موضعية مع الحد الأدنى من الانتشار إلى المناطق المجاورة. يؤدي استخدام محلول فيروس عالي العيار إلى زيادة العدوى في المناطق المجاورة مثل الحصين ، على الأرجح بالحقن بمحلول فيروس منخفض العيار. ينتج عن عدوى متفرقة عادة بالقرب من موقع الحقن مثل حقن المخيخ في خط الوسط ، يجب أن يرتبط عدد الخلايا المصابة بعيار المحلول الفيروسي المحقون.
على سبيل المثال ، يؤدي حقن مزيج من المحاليل عالية العيار لثمانية فيروسات R AAV التي تعبر عن بروتينات فلورية مختلفة في المخيخ ، إلى إصابة العديد من خلايا الكنجي التي تم تصنيفها بشكل تفاضلي. على العكس من ذلك ، يمكن أن يؤدي حقن محلول فيروس منخفض العيار إلى عدوى متفرقة للمساعدة في تصور الخلايا المفردة. يمكن ملاحظة الخلايا العصبية المصنفة بالفلورسنت مباشرة في الأنسجة الحية المقطوعة حديثا ، أو يمكن أن تتعرض للتلطيخ المناعي.
هذا يعزز إشارات الفلورسنت الداخلية للحصول على الصور لاحقا عن طريق المجهر الفلوري واسع المجال أو متحد البؤر. أخيرا ، RAAV eight قادر على إصابة مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا العصبية في القشرة من خلال وضع علامات قوية على العمليات الدقيقة بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في حوالي 30 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
تصف هذه المقالة طريقة in vivo لاختبار وظيفة الجين أثناء تطور الدماغ بعد الولادة باستخدام الفيروسات المرتبطة AAVs. عن طريق حقن هذه الفيروسات في أدمغة الفئران حديثي الولادة، يمكن للباحثين تحقيق تعطيل الجين الفسيفسائي وتمييز الخلايا العصبية المتناثرة، مما يسهل تحليل وظيفة الجين في تطور الدوائر العصبية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- وظيفة الجين
- تطور الدوائر العصبية
الخلفية
- فهم وظيفة الجين أثناء تطور الدماغ بعد الولادة أمر بالغ الأهمية.
- يمكن استخدام الفيروسات المرتبطة AAVs للتلاعب في التعبير الجيني.
- تتيح هذه الطريقة دراسة التنظيم الجيني خلال فترات التطور الحاسمة.
- يمكن لميكروسكوب التألق المناعي التمييز بين الخلايا الخاضعة للرقابة والخلايا المعدلة وراثيًا.
هدف الدراسة
- لتلاعب في وظيفة الجين خلال فترة تطور الدماغ بعد الولادة.
- للتحقيق في كيفية تنظيم العوامل الوراثية للتطور العصبي بعد الولادة.
- لتوفير رؤى حول الآليات الكامنة وراء تكوين الدوائر العصبية.
الطرق المستخدمة
- اختيار وتحضير الفيروسات المرتبطة AAVs المناسبة.
- حقن الفيروسات في أدمغة صغار الفئران حديثي الولادة.
- ميكروسكوب التألق المناعي لتصوير المناطق المحقونة.
- تحليل التمييز في تمييز الخلايا الخاضعة للرقابة والخلايا المعدلة وراثيًا.
النتائج الرئيسية
- حققت تعطيل الجين وتمييز الخلايا العصبية بنجاح.
- تظهر النتائج التنظيم الجيني للتطور بعد الولادة.
- توفر الطريقة إطارًا لأبحاث علم الأعصاب المستقبلية.
- توفر الرؤى المكتسبة فهمًا لديناميات الدوائر العصبية.
الاستنتاجات
- هذه الطريقة فعالة لدراسة وظيفة الجين في الدماغ النامي.
- تساهم النتائج في فهم تطور الدوائر العصبية.
- يمكن للبحوث المستقبلية البناء على هذه الطريقة لاستكشاف التأثيرات الوراثية على السلوك.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method enables rapid, scalable interrogation of gene function in postnatal brain development, addressing a critical gap in target validation for neurodevelopmental disorders. By bypassing embryonic lethality constraints, it supports mechanistic de-risking of therapeutic targets in pathways relevant to autism and schizophrenia. The approach provides predictive confidence in target selection by linking genetic perturbation to circuit-level phenotypes in a physiologically relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in postnatal neural circuits where many neurodevelopmental disorder genes exert their effects.
- Operational Value: Achieves mosaic gene inactivation and sparse labeling within days, avoiding months-long conditional mouse model generation.
- Scientific Value: Supports cell-autonomous functional analysis of genes implicated in axonal growth, dendritic tiling, and synapse refinement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively comparable control and knockout cell populations via differential fluorescent labeling for side-by-side phenotypic assessment.
- Operational Value: Permits titration of viral titer to modulate infection density, enabling scalable sparse or dense labeling as needed for downstream assays.
- Scientific Value: Compatible with immunofluorescence and electrophysiology readouts, facilitating multimodal validation of target engagement and circuit impact.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models postnatal genetic perturbation in mice and rats, aligning with the developmental timing of human neuropsychiatric disorder onset.
- Operational Value: Extends to lentiviral delivery and shRNA/dominant-negative constructs, broadening target modulation toolkit for preclinical validation.
- Scientific Value: Enables study of gene function in critical processes like synapse formation, directly relevant to pathophysiological mechanisms in psychiatric disorders.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting target validation and lead identification by providing causal genetic evidence in postnatal neural circuits prior to compound screening.
- Discovery Biology: Tests therapeutic hypotheses by deleting candidate genes in defined brain regions to assess phenotypic consequences on neural circuit maturation.
- Screening: Produces standardized, reproducible neuronal preparations with internal controls (labeled vs. unlabeled cells) for reliable compound effect measurement.
- Analytics: Generates quantitative imaging and electrophysiology readouts that enable statistical comparison of genotypes and treatment conditions.
- Translational Research: Connects genetic manipulation to circuit-level outcomes, supporting biomarker-aligned preclinical validation of target modulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable viral delivery platform applicable across multiple gene targets and brain regions, reducing redundant model development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by linking postnatal gene loss to specific circuit phenotypes.
- Operational Value: Standardizes gene perturbation via viral delivery, improving reproducibility across laboratories and studies.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions by rapidly establishing genetic causality in disease-relevant postnatal windows.
- Portfolio Impact: De-risks target advancement by providing functional evidence in systems that model human neurodevelopmental timing.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal mouse handling, stereotaxic injection, and viral biosafety protocols.
- Dependent on access to purified recombinant AAV or lentiviral vectors and fluorescence microscopy infrastructure.
- Necessitates standardization of viral titer, injection volume, and anesthesia procedures for cross-study consistency.
- Adaptation to different brain regions or species may require optimization of injection coordinates and viral serotype tropism.
- Practical limitation: Efficacy depends on Cre recombinase efficiency and floxed allele availability, which may vary across targets.
