تحليل فسيفساء من وظائف الجينات في الدماغ بعد الولادة ماوس التنمية عن طريق استخدام فيروس لجنة المساواة العرقية القائمة على التوحد

الهدف العام من هذا الإجراء هو التلاعب بوظيفة الجينات خلال فترة ما بعد الولادة من نمو الدماغ. يتم تحقيق ذلك عن طريق اختيار الفيروسات المناسبة أولا وإعدادها ، وتحميلها في المحقنة وإعداد معدات الحقن. ثم يتم حقن الفيروس في أدمغة صغار الفئران حديثي الولادة ، والخطوة الأخيرة هي التضحية بالحيوانات وتصوير المناطق المحقونة.

في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر وضع العلامات التفاضلية لخلايا التحكم والضربة القاضية من خلال الفحص المجهري المناعي الفلوري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل كيفية تنظيم فترة تطور ما بعد الولادة وراثيا. للحقن ، يمكن استخدام محلول الفيروس المرتبط بالغدة المتاح تجاريا بالعيار الكامل ، عادة من 10 إلى 12 ، نسخ الجينوم لكل مليلتر لمعالجة عدد كبير من الخلايا.

إذا كانت هناك رغبة في وضع العلامات أو الملصقات ، فابدأ بتخفيف من واحد إلى 10. بعد إذابة الفيروس على الجليد ، انقل على الفور حجم التخفيف المسبق إلى أنبوب PCR معقم سعة 250 ميكرولتر. حافظ على التخفيف على الجليد. الآن.

قم بإعداد مضخة الحقن عن طريق اختيار حقنة مناسبة وتوصيلها بإبرة تحميل. بعد ذلك ، ارسم محلول الفيروس برفق حتى تظهر فقاعة هواء صغيرة جدا في المحقنة ويمكن استخدام صبغة التحميل الخاملة لتسهيل هذه الخطوة. الآن قم بتثبيت المحقنة في المضخة باستخدام التجنيب.

ثم قم بتوصيل الأنابيب الضامة برفق بين المحقنة وحامل الإبرة. تأكد من أن إبرة الحقن على اتصال مباشر بالأنبوب الضام داخل حامل الإبرة. الآن ، حرك المحلول ببطء عبر الأنبوب الضام حتى تظهر قطرة صغيرة من المحلول عند طرف الإبرة.

قم بتأمين المكبس بعناية بجوار كتلة الدفع بقوس على المضخة. اضبط معدل الحقن على ثمانية ميكرولتر في الدقيقة واضبط حجم الحقن على ما بين ميكرولتر وميكرولتر. ثم اضبط إعداد قطر حقنة المضخات لتتناسب مع قطر المحقنة التي تستخدمها.

أخيرا ، لحماية الجراء أثناء مرحلة التعافي ، اضبط الصفيحة الساخنة على 38 درجة مئوية وقم بتغطيتها بمنشفة ورقية. باستخدام بروتوكول معتمد من IACUC ، قم بإعداد صغار الفأر P صفر أو P واحد للحقن عن طريق إخضاعهم للتخدير البارد. بلل بعض المناشف الورقية بالماء وضعها على الثلج.

ثم ضع أربعة أو خمسة صغار على منشفة ورقية مفصولة جيدا. قم بطي المناشف الورقية فوق الجراء ، ضع برفق كمية صغيرة من الثلج المجروش فوق المناشف الورقية واحتضن الجراء لمدة خمس دقائق تقريبا. يمكن الاحتفاظ بالجراء بأمان على الجليد لمدة تصل إلى 15 دقيقة ولا يزال يتعافى بشكل جيد.

الآن ضع جروا مخدر على كتلة تثبيت للحصول على أفضل وصول إلى موقع الحقن. يمكن الوصول إلى القشرة ، على سبيل المثال ، بسهولة أكبر عن طريق وضع بشكل مسطح على بطنه. يمكن تثبيت الجرو في مكانه باستخدام ضمادة ، وتثبيت رأس الجرو يدويا وسحب الجلد بإحكام لمنعه من الحركة.

ثم انتقل إلى المعالم التشريحية للجمجمة مثل خياطة لامدا ، وحدد نقطة حقن قابلة للتكرار باليد الأخرى ، وأدخل الإبرة برفق من خلال الجمجمة. لا تضغط بقوة إذا لم تخترق الإبرة الجمجمة بسهولة. بدلا من ذلك ، أعد وضع الإبرة وحاول برفق مرة أخرى.

يختلف عمق الحقن قليلا بين الفردية والسلالات في القشرة ، وعادة ما يعمل عمق نصف إلى ملليمتر واحد. الآن ، قم بحقن محلول الفيروس عن طريق جعل أحد الزملاء ينشط المضخة لتقليل حركات اليد. من الناحية المثالية ، يمكن استخدام دواسة القدم لبدء تشغيل المضخة بعد الحقن.

احتفظ بالإبرة في مكانها لبضع ثوان ، ثم حافظ على رأس الجرو بسلاسة. حرك الإبرة للخارج. الآن ، اسمح للجرو بالتعافي لمدة خمس إلى 10 دقائق على اللوحة الساخنة المغطاة.

خلال هذا الوقت ، استمر في حقن الجراء الأخرى. عندما يستعيد الجراء لونهم الوردي ويتحركون جميعا ، افركهم برفق بجزء من فراش منزلهم. عندها فقط يمكن إعادتهم إلى والدتهم.

خلاف ذلك ، يمكن معاملتهم على أنهم صغار غير مألوفة ، والتي من المرجح أن تقتلها الأم بعد إعادة الجراء إلى والدتهم. قم بتنظيف إعداد الحقن عن طريق تحميل المحقنة بالكامل بالأسيتون أو 70٪ الإيثانول. إذا كانت المكونات الحساسة للأسيتون مثل السانو والمواد اللاصقة قيد الاستخدام ، فقم بغسل المحلول من خلال إعداد الحقن عدة مرات باستخدام محلول جديد في كل مرة.

سيؤدي ذلك إلى إزالة أي محلول فيروسي متبقي ويترسب المذيبات. بعد التخلص من الإعداد ، قم بتطهير منطقة عمل المبيض لتركها جاهزة للمجرب التالي. معلمه. تنتج التقنية الناجحة عدوى عصبية قوية في موقع الحقن.

عادة ما تؤدي الحقن في مناطق محددة مثل القشرة والقولون العلوي إلى حدوث عدوى موضعية مع الحد الأدنى من الانتشار إلى المناطق المجاورة. يؤدي استخدام محلول فيروس عالي العيار إلى زيادة العدوى في المناطق المجاورة مثل الحصين ، على الأرجح بالحقن بمحلول فيروس منخفض العيار. ينتج عن عدوى متفرقة عادة بالقرب من موقع الحقن مثل حقن المخيخ في خط الوسط ، يجب أن يرتبط عدد الخلايا المصابة بعيار المحلول الفيروسي المحقون.

على سبيل المثال ، يؤدي حقن مزيج من المحاليل عالية العيار لثمانية فيروسات R AAV التي تعبر عن بروتينات فلورية مختلفة في المخيخ ، إلى إصابة العديد من خلايا الكنجي التي تم تصنيفها بشكل تفاضلي. على العكس من ذلك ، يمكن أن يؤدي حقن محلول فيروس منخفض العيار إلى عدوى متفرقة للمساعدة في تصور الخلايا المفردة. يمكن ملاحظة الخلايا العصبية المصنفة بالفلورسنت مباشرة في الأنسجة الحية المقطوعة حديثا ، أو يمكن أن تتعرض للتلطيخ المناعي.

هذا يعزز إشارات الفلورسنت الداخلية للحصول على الصور لاحقا عن طريق المجهر الفلوري واسع المجال أو متحد البؤر. أخيرا ، RAAV eight قادر على إصابة مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا العصبية في القشرة من خلال وضع علامات قوية على العمليات الدقيقة بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في حوالي 30 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.