الجلد ثلاثي الأبعاد إعادة بناء الإنسان النموذجي : أداة لدراسة بشرة العادية والتقدم الميلانوما

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للجلد البشري لدراسات بيولوجيا الخلايا الميلانينية، والميلانوما، والخلايا الجذعية الجلدية. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال طلاء قطعة إدراج في صواني زراعة الأنسجة بالكولاجين البقري المتعادل. وتتمثل الخطوة الثانية في تكوين الحيز الجلدي الخلوي من الخلايا الليفية والكولاجين.

بعد ذلك، يتم تحضير الحجرة البشرية من الخلايا الكيراتينية المخلوطة بالخلايا الميلانينية أو خلايا الميلانوما. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في حصاد الجلد المعاد بناؤه في اليوم 18 وزراعته في فأر. وفي النهاية، تُظهر التحاليل الكيميائية النسيجية المناعية والفلورية المناعية للطعم بنية الجلد الطبيعي التي تحتوي على الخلايا الميلانينية، وهجرة وتمايز الخلايا الجذعية الطبيعية والأنماط الظاهرية للميلانوما الخاصة بمرحلة معينة.

لقد قمنا بتطوير نموذج إعادة بناء الجلد منذ 20 عاماً لأننا وجدنا في مراحل مبكرة من دراساتنا أن الخلايا الميلانينية الطبيعية أو خلايا الميلانوما التي يتم استزراعها في طبق مخبرية تتصرف بشكل مختلف تماماً عن الخلايا الموجودة في سياق نسيجي. لذا، يعد نموذج إعادة بناء الجلد مثالياً بالنسبة لنا لمراقبة كيفية انتقال الخلايا من حجرة واحدة في الجلد إلى أي مكان آخر. قم بتبريد خليط الكولاجين للطبقة غير الخلوية التي تم تحضيرها مسبقاً على الثلج، ثم أضف 1 mL من المحلول الأصفر القشي في كل إدراج من مجموعة ستة.

ضع صينية زراعة الأنسجة في الحاضنة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح للهلام بالتصلب. خلال هذه الفترة، يجب أن يتغير لون المحلول من الأصفر إلى الوردي أثناء تصلب الهلام. قم بهضم خلايا fibroblast البشرية من قارورة الزراعة باستخدام 0.25%tripsin EDTA بعد خمس دقائق. أضف DMEM الذي يحتوي على 10%FBS لتحييد عملية التثبيت.

اجمع الخلايا المنفصلة عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 200 G في درجة حرارة الغرفة، ثم أعد تعليق الخلايا بكثافة 4.5 × 10⁵ خلية لكل 1.5 ملليلتر من وسط DMEM المكمل بنسبة 10% FBS. بعد ذلك، املأ أنبوباً سعة 50 ملليلتر من خليط كولاجين الطبقة الخلوية الذي تم تحضيره مسبقاً وضع الأنبوب على الثلج.

أضف 1.5 milliliters من معلق الخلايا الليفية (fibroblast) إلى الأنبوب واخلط جيداً. أضف ثلاثة milliliters من محلول الطبقة الخلوية ذي اللون الأصفر القشي إلى كل قطعة إدراج مغلفة بطبقة غير خلوية. ثم حضّن صينية زراعة الأنسجة لمدة 45 دقيقة عند 37 °C في حاضنة زراعة أنسجة تحتوي على 5% carbon dioxide خلال فترة التحضين.

يجب أن يتغير لون محلول الطبقة الخلوية أيضاً من الأصفر إلى الوردي. بعد تصلب هلام الطبقة العلوية، أضف 2 mL من DMEM المحتوي على 10% FBS إلى داخل الغرسة في صينية زراعة الأنسجة، و 10 mL إلى خارج الغرسة. يتم تحضين صواني زراعة الأنسجة لمدة أربعة أيام.

في اليوم الرابع، وللتأكد من انكماش الهلام في اليوم الرابع من الحضن، يتم سحب الوسط من داخل وخارج كل قطعة إدراج. أضف 2 mL من وسط الغسيل إلى داخل القطع و 10 mL إلى خارجها لغسل المصل العادي. ثم يتم حضن الصواني لمدة ساعة واحدة عند 37 °C لتوليد البشرة.

أولاً، يتم عمل تريبسين للخلايا الكيراتينية البشرية. ثم بعد خمس دقائق، يُستخدم مثبط تريبسين فول الصويا لمعادلة التريبسين بعد تدوير الخلايا المنفصلة عند 200 G لمدة خمس دقائق. ثم يتم إعادة تعليق كتلة الخلايا بتركيز 4.17 × 10⁶ خلية لكل ملليلتر في وسط الجلد.

أعد تركيب الوسط الأول بعد حصاد الخلايا الكيراتينية. قم بمعالجة الخلايا الميلانية البشرية بالتريبسين على الجليد لمدة تتراوح من دقيقة إلى دقيقتين. بعد ذلك، قم بمعادلة التريبسين باستخدام مثبط تريبسين الصويا.

بعد ذلك، وبعد تدوير الخلايا تحت نفس الظروف السابقة، أعد تعليق كتلة الخلايا الميلانينية (melanocyte pellet) بكثافة 8.3 × 10⁵ خلية لكل ملليلتر في الوسط الغذائي. قم أيضاً بتحضير الوسط الغذائي رقم 1. بعد ذلك، قم بإزالة وسط الغسيل من داخل وخارج كل قطعة إدراج (insert) في صينية زراعة أنسجة مُعدة بطبقة أدمية.

استبدل وسط الغسيل بإضافة 1.5 milliliters من وسط إعادة بناء الجلد، بحيث يتم وضع كمية واحدة في الداخل و10 milliliters في الخارج من كل قطعة إدخال. بعد ذلك، اخلط 600 microliters من معلق خلايا keratinocyte مع 600 microliters من معلق خلايا melanocyte. ثم وزع 200 microliters من معلق الخلايا المختلط.

أضف المحلول قطرة بقطرة إلى داخل كل قطعة إدراج. يتم تحضين صينية زراعة الأنسجة لمدة يومين عند 37 درجة مئوية. بعد تحضين الخلايا، قم بشفط وسط إعادة بناء الجلد 1 من داخل وخارج كل قطعة إدراج، ثم أضف 2 مل من وسط إعادة بناء الجلد 2 إلى الداخل و 10 مل إلى الخارج من قطعة الإدراج.

ثم يتم تحضين نماذج إعادة البناء لمدة يومين آخرين عند 37 degrees celsius. وبعد فترة التحضين الثانية التي تستمر يومين، يتم سحب وسط إعادة بناء الجلد 2 من داخل وخارج كل مدرج. الآن، يتم إضافة 7.5 milliliters من وسط إعادة بناء الجلد 3 إلى الجزء الخارجي فقط من المدارج.

أعد النماذج المعاد بناؤها إلى الحاضنة وقم بتغيير الوسط الغذائي للجلد. استبدل الوسط الغذائي الثالث لإعادة البناء كل يومين حتى اليوم 18. في اليوم 18 من فترة الحضن، قم بسحب الأوساط الغذائية من داخل وخارج المدرجات في صينية زراعة الأنسجة المحملة بنماذج الجلد المعاد بناؤها.

قم بإزالة الإضافات من الصينية باستخدام الملقط. قصّ البنية بما في ذلك مرشح البوليكربونات عن طريق رسم دائرة بالقرب من الحافة باستخدام شفرة المشرط. ثم ضع البنية الموجودة في المرشح على سطح صلب وقصّها إلى نصفين باستخدام الشفرة.

ضع نصف إعادة البناء على ورقة خزعة TBS سوداء، ثم ضع الورقة في كاسيت نسيجي. اغمر الكاسيت بالكامل في فورمالين 10% لأكثر من أربع ساعات. بعد ذلك، ضع الكاسيت في إيثانول 70% واحفظه عند درجة حرارة أربع درجات مئوية حتى تصبح جاهزاً لمعالجة إعادة البناء من أجل الطمر في البارافين.

ضع النصف الآخر من العينة المعاد بناؤها في سكروز 50% عند درجة حرارة 4 °C لمدة تتراوح بين ساعة وساعتين. ثم استبدل السكروز بتركيز 2 molar وقم بتخزينها عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعة إلى ساعتين إضافيتين. املأ نصف قالب القاعدة بوسط تجميد درجة حرارة القطع المثالية أو OCT.

تجنب تكون أي فقاعات. أمسك حافة العينة المعاد بناؤها باستخدام الملاقط وأخرجها من السكروز. ضعها على مناديل Kim wipes حتى يتم امتصاص السكروز.

باستخدام الملقط والملعقة، انقل الجزء المعاد بناؤه إلى القارب الموجود فوق الـ OCT. غطِّ الجزء العلوي من الجزء المعاد بناؤه بمزيد من الـ OCT حتى يمتلئ القارب تماماً، مع تجنب تكوين الفقاعات مرة أخرى.

ضع القارب بالتساوي على الجليد الجاف المسحوق للسماح بتجميد OCT تماماً. بعد ذلك، قم بتغليف قالب القاعدة والرقائق واحفظه في درجة حرارة -70 °C حتى يحين موعد قطعه باستخدام الميكروتوم المجمد (cryostat). وللتحضير لزراعة إعادة بناء الجلد على فأر، املأ وعاءً بالنيتروجين السائل وأضف 5 mL من DMEM إلى أنبوب سعة 50 mL.

املأ دورقاً بـ 600 milliliters من مياه الصنبور وضع الدورق فوق لوح تسخين للتدفئة. بعد ذلك، اختر فأرة إناث من سلالة skid hairless outbred يبلغ عمرها حوالي ستة أسابيع. وبعد تخدير الفأرة باستخدام isof fluorine.

استخدم قناعاً أنفياً للحفاظ على التخدير طوال فترة الإجراء. ضع ملَيناً عينيّاً معقماً ووفر دعماً حرارياً لمنع انخفاض درجة حرارة الجسم. بعد ذلك، نظف جلد الفأر باستخدام صبغة البنزوين المركبة ومسحات كحولية تحضيرية.

ضع علامة بخط على ظهر الفأر للحفاظ على نفس الموضع عند إجراء الخياطة لاحقاً. قم بعمل جرح دائري في ظهر الفأر باستخدام مقص القزحية والملقط، ثم غطِّ منطقة الجرح بقطع شاش معقمة. ضع قطعة الجلد الدائرية المقتطعة من الفأر في أنبوب سعة 50 milliliter يحتوي على DMEM.

اغمر الأنبوب في حاوية نيتروجين سائل حتى يتجمد الوسط النسيجي والأنسجة تماماً. بعد ذلك، قم بإذابة الأنبوب في دورق يحتوي على ماء ساخن حتى يذوب تماماً. كرر إجراء التجميد والإذابة هذا ثلاث مرات.

استخدم شفرة جراحية لفصل إعادة بناء الجلد عن القالب. أزل الغشاء بحذر شديد، ثم انقل إعادة بناء الجلد إلى الجزء العلوي من سرير جرح الفأر. الآن، ضع جلد الفأر فوق إعادة بناء الجلد.

تأكد من وضع الغرزة الأولى فوق العلامة المحددة مسبقاً، وأن تكون الثانية في الأسفل. ثم استخدم غرزتين إضافيتين على جانبي الجلد المعاد بناؤه لتثبيت جلد الفأر. قم بتنظيف جلد الفأر بعد عملية التطعيم، ثم ضع الفأر في قفص جديد.

في اليوم 18، تتكون البشرة في الجلد المعاد بناؤه من طبقات متراصفة من الخلايا القرنية، حيث تترتب الطبقة القاعدية غير المتمايزة والطبقات المتمايزة تتابعياً بشكل عمودي. يتم صبغ مقطع من الأنسجة المعاد بناؤها باستخدام واسم الخلايا الميلانينية.

يوضح S 100، كما تشير الأسهم السوداء، أن الخلايا الميلانينية مصطفة في الطبقة القاعدية للبشرة وتتواصل مع العديد من الخلايا الكيراتينية عبر تفرعات شجيرية. ويحتوي الحيز الأدمي على أرومات ليفية مغمورة في مصفوفة من الكولاجين من النوع الأول، بينما يشير الكولاجين أربعة المترسب إلى الغشاء القاعدي الذي يفصل البشرة عن الأدمة. وتوضح الأشكال التالية كيفية تطور طبقات متعددة من الخلايا الكيراتينية في البشرة.

عندما يتم دمج الخلايا الجذعية الجلدية الموصومة بـ ناقل lentiviral GFP مع الخلايا الليفية في مصفوفة من الكولاجين من النوع الأول، فإنها تهاجر إلى البشرة وتتمايز إلى خلايا ميلانينية في اليوم الخامس. وبعد استزراع الخلايا الكيراتينية، تبدأ الخلايا المفردة في الهجرة من الكرات.

لاحظ أن البشرة لا تزال تتكون من طبقة واحدة. وفي اليوم الثامن، تصل بعض الخلايا إلى الواجهة بين البشرة والأدمة.

بحلول اليوم العاشر، تصطف الخلايا الموجبة لـ GFP بشكل وثيق عند موقع الغشاء القاعدي كما يمكن رؤيته هنا. وتعبر الخلايا الموجبة لـ GFP المهاجرة في البشرة عن مؤشر الخلايا الميلانينية HMB 45. وعندما يتم دمج سلالات خلايا الميلانوما في مراحل مختلفة في عمليات إعادة بناء الجلد، فإن سلوك الخلايا يعكس خصائصها في الجسم الحي.

تظهر في هذا الشكل الخلايا الميلانينية الطبيعية وخلايا الميلانوما التي تم استنباتها في مزارع ثنائية الأبعاد. كما يظهر هنا، فإن موقع ومعدل نمو الخلايا الميلانينية الطبيعية يتم التحكم فيهما بدقة في عمليات إعادة بناء الجلد؛ ففي مرحلة النمو الشعاعي، تتكاثر الأورام الميلانينية الأولية بشكل أساسي في البشرة، بينما تنمو أورام مرحلة النمو العمودي بشكل غازٍ داخل الأدمة كما هو موضح في هذا الشكل. وأخيرًا، يمكن رؤية الطريقة التي تغزو بها الأورام الميلانينية النقيلية عمق الأدمة بشراسة هنا.

توفر دراساتنا على الجلد الطبيعي الأساس لمعرفة أفضل بتطور وسير مرض الميلانوما.