الجلد ثلاثي الأبعاد إعادة بناء الإنسان النموذجي : أداة لدراسة بشرة العادية والتقدم الميلانوما

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لجلد الإنسان لدراسات الخلايا الصباغية والورم الميلانيني وبيولوجيا الخلايا الجذعية الجلدية. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء صواني زراعة الأنسجة أولا بالكولاجين البقري المحايد. الخطوة الثانية هي صنع الحيز الجلدي الخلوي من الخلايا الليفية والكولاجين.

بعد ذلك ، اصنع حجرة البشرة من الخلايا الكيراتينية الممزوجة بالخلايا الصباغية أو خلايا الورم الميلانيني. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في حصاد إعادة بناء الجلد في اليوم 18 وتطعيم إعادة بناء الجلد على الفأر. في النهاية ، تظهر التحليلات الكيميائية المناعية والفلورية المناعية للطعم بنية الجلد الطبيعي الذي يحتوي على الخلايا الصباغية ، وهجرة وتمايز الخلايا الجذعية الطبيعية والأنماط الظاهرية للورم الميلانيني النوعي للمرحلة.

لقد طورنا نموذج إعادة بناء الجلد منذ 20 عاما لأننا وجدنا في وقت مبكر من دراساتنا أن الخلايا الصباغية الطبيعية أو خلايا الورم الميلانيني التي يتم زراعتها في طبق تتصرف بشكل مختلف تماما عن الخلايا الموجودة في سياق الأنسجة. لذا فإن نموذج إعادة بناء الجلد مثالي بالنسبة لنا لنرى كيف تنتقل الخلايا من حجرة واحدة في الجلد إلى أي مكان آخر. خليط الكولاجين الطبقة الخلوية المحضر مسبقا على الثلج ، ثم أضف ملليلترا واحدا من محلول القش الأصفر إلى كل إدخال من ستة.

صينية زراعة الأنسجة الجيدة تحتضن الدرج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح للهلام بالتصلب. خلال هذا الوقت ، يجب أن يتغير لون المحلول من الأصفر إلى الوردي بينما يعمل الجل على ترسيخ عيون التربسين ، والألياف البشرية من قارورة الثقافة الخاصة بهم مع 0.25٪ تريبسين في EDTA بعد خمس دقائق. أضف DMEM الذي يحتوي على 10٪ FBS لتحييد عملية التحييد.

اجمع الخلايا المنفصلة عن طريق الطرد المركزي لمدة خمس دقائق عند 200 جم في درجة حرارة الغرفة ، ثم أعد تعليق الخلايا عند 4.5 في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل 1.5 ملليلتر. DMEM مكمل بنسبة 10٪ FBS. بعد ذلك ، املأ أنبوبا سعة 50 مليلتر بخليط الكولاجين ذي الطبقة الخلوية المحضر مسبقا وضع الأنبوب على الثلج.

أضف 1.5 مل من تعليق الخلايا الليفية إلى الأنبوب واخلطه. أضف ثلاثة ملليلتر من محلول الطبقة الخلوية الصفراء القش إلى كل ملحق مطلي بطبقة لا خلوية. ثم احتضان صينية زراعة الأنسجة لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة أنسجة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ خلال فترة الحضانة.

يجب أن يتغير لون محلول الطبقة الخلوية أيضا من الأصفر إلى الوردي. بعد أن تصلب جل الطبقة العليا ، أضف ملليلترين من DMEM يحتوي على 10٪ FBS إلى داخل الملحق في صينية زراعة الأنسجة ، و 10 ملليلتر إلى الخارج من الملحق. احتضن صواني زراعة الأنسجة لمدة أربعة أيام.

التحقق في اليوم الرابع من تقلص الجل في اليوم الرابع من الحضانة ، استنشق الوسط من داخل وخارج كل إدخال. أضف ملليلترين من وسط الغسيل إلى الداخل و 10 ملليلتر إلى الخارج من الإدخالات لغسل المصل العادي. ثم احتضان الصواني لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية لتوليد البشرة.

التربسين الأول هو الخلايا الكيراتينية البشرية. ثم بعد خمس دقائق ، استخدم مثبط التربسين من فول الصويا لتحييد التربسين بعد تدوير الخلايا المنفصلة عند 200 جم لمدة خمس دقائق. يعلق Reus حبيبات الخلية عند 4.17 في 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر في الجلد.

إعادة بناء وسط واحد بعد حصاد الخلايا الكيراتينية. التربسين الجليد الخلايا الصباغية البشرية لمدة دقيقة إلى دقيقتين. مرة أخرى ، قم بتحييد التربسين باستخدام مثبط فول الصويا التربسين.

ثم بعد تدوير الخلايا في نفس الظروف كما كان من قبل ، قم بإعادة تعليق حبيبات الخلايا الصباغية عند 8.3 في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر في الجلد. إعادة بناء وسيط أيضا. بعد ذلك ، قم بإزالة وسط الغسيل من الداخل والخارج لكل إدراج لصينية زراعة الأنسجة المعدة بطبقة جلدية.

استبدل وسط الغسيل بإضافة 1.5 مل من الجلد ، وإعادة بناء الوسط ، واحد إلى الداخل و 10 مل إلى الخارج من كل إدخال. ثم امزج 600 ميكرولتر من تعليق خلية الخلايا الكيراتينية مع 600 ميكرولتر من تعليق الخلايا الصباغية. استغن عن 200 ميكرولتر من تعليق الخلية المختلطة.

قطرة قطرة إلى داخل كل إدراج. احتضان صينية زراعة الأنسجة لمدة يومين عند 37 درجة مئوية. بعد احتضان الخلايا ، قم بشفط الجلد ، وأعد بناء وسيط واحد من داخل وخارج كل إدراج ، ثم أضف ملليلترين من الجلد ، وأعد بناء الوسط ، اثنان في الداخل و 10 ملليلتر إلى الخارج من الإدراج.

ثم احتضان عمليات إعادة البناء لمدة يومين آخرين عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة الثانية لمدة يومين ، قم بشفط الجلد ، وأعد بناء وسيطين من الداخل والخارج لكل إدخال. أضف الآن 7.5 مل من الجلد ، وأعد بناء متوسط ثلاثة إلى الجزء الخارجي من الإدخالات فقط.

ضع عمليات إعادة البناء مرة أخرى في الحاضنة وقم بتغيير الجلد. أعد بناء متوسط ثلاثة كل يومين حتى اليوم 18. في اليوم 18 من الحضانة ، قم بشفط الوسائط من الداخل والخارج لإدراج صينية زراعة الأنسجة المحملة بإعادة بناء الجلد.

قم بإزالة الإدخالات من الدرج بالملقط. قم بقص الهيكل بما في ذلك مرشح البولي كربونات عن طريق تتبع دائرة قريبة من الحافة بشفرة مشرط. ثم ضع إعادة البناء في الفلتر على سطح صلب واقطعها إلى نصفين بالشفرة.

ضع نصف إعادة البناء على ورق خزعة TBS أسود ، ثم ضع الورقة في شريط الأنسجة. انقع الكاسيت بالكامل في 10٪ فورمالين لأكثر من أربع ساعات. ثم ضع الكاسيت في 70٪ من الإيثانول وقم بتخزينه على أربع درجات مئوية حتى تصبح جاهزا لمعالجة إعادة البناء لتضمين البارافين.

ضع النصف الآخر من إعادة البناء في 50٪ سكروز عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين. ثم قم بتغيير السكروز إلى اثنين من الضرس ثم قم بتخزينه على أربع درجات مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين أخريين. املأ قالب القاعدة في منتصف الطريق بدرجة حرارة القطع المثلى أو وسائط التجميد أو OCT.

تجنب أي فقاعات. أمسك حافة إعادة البناء بالملقط وقم بإزالة إعادة البناء من السكروز. ضعه على مناديل كيم المبللة حتى يتم امتصاص السكروز.

باستخدام ملقط وملعقة ، انقل إعادة البناء إلى القارب أعلى OCT. قم بتغطية الجزء العلوي من إعادة البناء بمزيد من OCT حتى يمتلئ القارب تماما. مرة أخرى ، تجنب الفقاعات.

ضع القارب بالتساوي على الثلج الجاف المسحوق للسماح ل OCT بالتجميد تماما. ثم لف القالب الأساسي والرقائق وقم بتخزينه على درجة حرارة 70 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزا لقصه باستخدام ناظم البرد. للتحضير لتطعيم إعادة بناء الجلد على الماوس ، املأ وعاءا بالنيتروجين السائل وأضف خمسة ملليلتر من DMEM إلى أنبوب سعة 50 مل.

املأ دورق ب 600 مل من ماء الصنبور وضع الدورق فوق طبق ساخن لتسخينه. ثم اختر أنثى فأرة انزلاقية خالية من الشعر ومولدة في حوالي ستة أسابيع من العمر. بعد تخدير الفأر بإيزيمن الفلور.

استخدم مخروط الأنف للحفاظ على التخدير طوال العملية. ضع مادة تشحيم العيون المعقمة وتوفر الدعم الحراري لمنع انخفاض حرارة الجسم. بعد ذلك ، قم بتنظيف جلد الفأر بصبغة البنزوين المركبة ومسحات تحضير الكحول.

ضع علامة على خط أعلى الماوس الخلفي للاحتفاظ بنفس الموضع للخياطة لاحقا. قم بقص سرير جرح دائري على ظهر الماوس باستخدام مقص القزحية والملقط ، ثم قم بتغطية فراش الجرح بإسفنج شاش معقم. ضع جلد الفأر المستدير في أنبوب 50 مليلتر من DMEM.

اغمر الأنبوب في وعاء من النيتروجين السائل حتى يتم تجميد جميع الوسائط والأنسجة تماما. بعد ذلك ، قم بإذابة الأنبوب في كوب من الماء الساخن حتى يذوب تماما. كرر هذا ، قم بالتجميد والذوبان ثلاث مرات.

استخدم شفرة جراحية لفصل إعادة بناء الجلد عن الحشوش. قم بإزالة الغشاء بعناية فائقة ثم انقل الجلد المعاد بناؤه إلى الجزء العلوي من سرير جرح الفأر. الآن ، ضع جلد الفأر فوق إعادة بناء الجلد.

تأكد من أن الخيط الأول أعلى العلامة المسماة مسبقا وأن الثانية في الأسفل. ثم استخدم خياطتين أخريين على جانبي الجلد لإعادة البناء لإصلاح جلد الفأر. نظف جلد الفأر بعد التطعيم ، ثم ضع الفأر في قفص جديد.

في اليوم 18. تتكون بشرة إعادة بناء الجلد من طبقات الخلايا الكيراتينية الطبقية ، والطبقة القاعدية غير المتمايزة والطبقات المتمايزة بالتتابع موجهة رأسيا. تلطيخ قسم إعادة البناء بعلامة الخلايا الصباغية.

S 100 كما هو موضح في الأسهم السوداء ، يوضح أن الخلايا الصباغية محاذاة في الطبقة القاعدية للبشرة وتتواصل مع الخلايا الكيراتينية المتعددة من خلال امتدادات التغصنات. تحتوي الحجرة الجلدية على خلايا ليفية مدمجة في مصفوفة كولاجين من النوع الأول تشير الكولاجين الراسب أربعة إلى الغشاء القاعدي الذي يفصل البشرة عن الأدمة. توضح الأشكال التالية كيفية تطوير طبقات متعددة من الخلايا الكيراتينية في البشرة.

عندما يتم تضمين الخلايا الجذعية الجلدية المصنفة بناقل الفيروسات العدسية GFP مع الخلايا الليفية. في مصفوفة الكولاجين من النوع الأول ، تهاجر إلى البشرة وتتمايز إلى خلايا ميلانينية في اليوم الخامس. بعد زرع الخلايا الكيراتينية ، تبدأ الخلايا المفردة في الهجرة من المجالات.

لاحظ أن البشرة لا تزال تتكون من طبقة واحدة. في اليوم الثامن. تصل بضع خلايا إلى واجهة أدمة البشرة.

بحلول اليوم 10 ، تتم محاذاة الخلايا الإيجابية GFP بإحكام في موضع الغشاء القاعدي كما يتضح هنا. تعبر الخلايا الإيجابية GFP المهاجرة في البشرة عن علامة الخلايا الصباغية HMB 45. عندما يتم دمج مراحل مختلفة من خطوط خلايا الورم الميلانيني في إعادة بناء الجلد ، يعكس سلوك الخلايا خصائصها في الجسم الحي.

هنا ، يمكن رؤية الخلايا الصباغية الطبيعية وخلايا الورم الميلانيني المزروعة في الثقافات ثنائية الأبعاد في هذا الشكل. يتم التحكم بإحكام في موقع ومعدل نمو الخلايا الصباغية الطبيعية في إعادة بناء الجلد كما هو موضح هنا ، مرحلة النمو الشعاعي ، تتكاثر الأورام الميلانينية الأولية في الغالب في البشرة ، بينما تنمو الأورام الميلانينية في مرحلة النمو الرأسي بشكل غازي في الأدمة كما هو موضح في هذا الشكل. أخيرا ، يمكن رؤية الطريقة التي تغزو بها الأورام الميلانينية النقيلية بقوة في عمق الأدمة هنا.

توفر دراساتنا على البشرة الطبيعية الأساس لمعرفة أفضل بتطور الورم الميلانيني وتطوره.