زراعة الخلايا البطانية من الأوعية الدقيقة لدماغ الفئران: إجراء لعزل وزراعة الخلايا البطانية من الأوعية الدقيقة لدماغ الفئران

لعزل الخلايا البطانية الدماغية ، أولا ، قم بنقل دماغ الفئران المحصود إلى طبق يحتوي على عازلة مبردة.

بعد إزالة المخيخ والأعصاب البصرية ، قسم الدماغ إلى نصفي الكرة المخية. ثم افصل الدماغ المتوسط عن الدماغ الأمامي.

قم بإزالة السحايا والمادة البيضاء المحتوية على المايلين من الدماغ الأمامي ، تاركا وراءها قشرة الدماغ لعزل الأوعية الدقيقة.

بعد ذلك ، قم بتجانس القشرة لكسر الأنسجة العصبية ومكوناتها.

الطرد المركزي المتجانس لإزالة الحطام الخلوي والمايلين.

بعد ذلك ، عالج حبيبات الأنسجة بكوكتيل هضم يحتوي على إنزيمات الكولاجيناز والتباين والديوكسيربونوكلياز.

تهضم الكولاجيناز والتباين المصفوفة خارج الخلية التي تدمج الأوعية الدقيقة ، مما يؤدي إلى تخفيف شظايا الأوعية الدقيقة من الأنسجة. تعمل منقوص الأكسجين بونوكليازات على تحلل أي حمض نووي حر يتم إطلاقه من الخلايا المحللة.

امزج الحجم المطلوب من المتجانس المهضوم مع وسط تدرج الكثافة المناسب وجهاز طرد مركزي.

تخلص من المايلين والطبقة العليا التي تحتوي على الخلايا المتني في الدماغ ، متبوعة بالطاف.

الآن ، عالج الحبيبات المحتوية على الأوعية الدقيقة بكوكتيل الهضم لتحرير شظايا الأوعية الدقيقة التي تتكون من الخلايا البطانية والخلايا الحضوجية تماما.

الطرد المركزي التعليق. أعد تعليق الحبيبات المحتوية على شظايا الوعاء الدقيق في وسط مناسب مكمل بالبورومايسين - مضاد حيوي.

قم بزرع المعلق في صفيحة مغطاة بالبروتين خارج الخلية واحتضنها.

تلتصق شظايا الأوعية الدقيقة بالطلاء الموجود في اللوحة. يزيل Puromycin الخلايا الحمضية بشكل انتقائي ، بينما تسهل مكونات الوسائط تكاثر الخلايا البطانية.

قم بإزالة الدماغ من جمجمة ثلاثة فئران ويستار البالغة من العمر 5 أسابيع وانقل الأدمغة إلى طبق بتري مليء بمحلول تشريح بارد مثبت على الجليد.

تشريح الأدمغة بدون المخيخ والأعصاب البصرية. بعد ذلك ، اقطع كل دماغ إلى نصفين لفصل نصفي الكرة الدماغية.

تحت المجهر المجسم ، قم بعمل قطع آخر لإزالة الدماغ المتوسط ونقل جميع الأدمغة الأمامية إلى طبق بتري نظيف على الجليد مع محلول تشريح.

بعد ذلك ، انقل أحد الدماغ الأمامي إلى طبق بتري جديد مليء بمحلول التشريح البارد. امسكها بالمشبك وافصل السحايا بعناية عن حواف الدماغ الأمامي.

بعد ذلك ، اقلب الدماغ الأمامي واسحب السحايا بعناية دون تمزيقها. تأكد من تطهير الدماغ الأمامي من السحايا وقطع الجزء المتبقي من الأعصاب البصرية. الهدف من هذه الخطوة هو إزالة لحاف المادة البيضاء للحصول على قشرة من القشرة.

ابدأ بتثبيت الدماغ الأمامي عند الحافة ثم اسحب الملقط بعناية على طول السطح ، مع الحرص على عدم تمزيق سطح القشرة.

بعد ذلك ، تأكد من خلو الدماغ من السحايا عن طريق تدحرجه للتحقق من عدم وجود سحايا متبقية أو أوعية سطحية كبيرة.

بعد ذلك ، بدءا من استخراج الأدمغة الثلاثة من جمجمتهم ، يجب ألا يستغرق الوقت الكامل للتشريح أكثر من ساعتين للحفاظ على الأنسجة وبقاء الخلايا. انقل قشر ثلاثة أدمغة إلى 6 ملليلتر من المخزن المؤقت للتشريح البارد في خالط Dounce سعة 7 ملليلتر.

بعد ذلك ، قم بفصل القشرة ب 10 ضربات لأعلى ولأسفل مع المدقة الأولى ذات الخلوص الأكبر ، تليها 10 ضربات لأعلى ولأسفل مع المدقة الثانية ذات الخلوص الأصغر.

بعد ذلك ، انقل 6 ملليلتر من التعليق إلى أنبوب فالكون جديد سعة 50 مليلتر واغسل الخالط Dounce ب 24 مل من المخزن المؤقت للتشريح البارد. قسم المعلق إلى ثلاثة أنابيب فالكون للحصول على ما يعادل قشرة واحدة لكل أنبوب.

بعد ذلك ، جهاز طرد مركزي عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تظهر مراقبة الحبيبات تدرجا من اللون الوردي ، والذي يمثل جزء الأوعية الدقيقة من تجانس القشرية.

الآن ، تخلص من المادة الطافية وقم بتجانس الحبيبات من قشرة واحدة مع 1 مليلتر من المحلول الأنزيمي الذي يحتوي على مزيج من الكولاجيناز ، والتباين ، ونوع DNase 1 ، والجنتاميسين.

ضع الأنابيب في شاكر لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ثم امزج 1 مليلتر من الهضم مع 10 ملليلتر من 25٪ BSA / HBSS 1X وقم بدوامة الأنابيب برفق. بعد ذلك ، افصلهما عن طريق الطرد المركزي المعتمد على الكثافة عند 3,600 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد الطرد المركزي المعتمد على الكثافة ، تحتوي الحبيبات على الأوعية الدقيقة ويحتوي القرص العلوي على المايلين وحمة الدماغ والأوعية الدقيقة المتبقية.

انقل القرص العلوي والطافي بعناية إلى أنابيب فالكون نظيفة سعة 50 مليلترا. احرص على عدم شفط حبيبات الأوعية الدقيقة.

قم بتدوير الأنبوب برفق وكرر الطرد المركزي المعتمد على الكثافة. خلال هذا الطرد المركزي الثاني ، احتفظ بالحبيبات الناتجة التي تحتوي على الأوعية الدقيقة عند 4 درجات مئوية.

بعد الطرد المركزي الثاني المعتمد على الكثافة ، تخلص بعناية من القرص العلوي والمادة الطافية. قم بخلط وتعليق الكريات الناتجة التي تحتوي على الأوعية الدقيقة من كلا الطرد المركزي مع 1 مليلتر من HBSS 1X البارد.

بعد ذلك ، اغسل الأوعية الدقيقة ب 20 مل من HBSS 1X البارد وأجهزة الطرد المركزي عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية ، مع الحرص على عدم فقد حبيبات الأوعية الدقيقة.

قم بتجانس حبيبات الأوعية الدقيقة من قشرة واحدة مع 1 مليلتر من نفس المحلول الأنزيمي بعد دوامة لطيفة من الأنابيب. علاوة على ذلك ، قم بهضم الأوعية الدقيقة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في شاكر. بعد ذلك ، قم بخلط الأوعية الدقيقة المهضومة من القشرة الثلاثة في أنبوب واحد.

مرة أخرى ، افصل الخليط إلى أنبوبين من فالكون سعة 50 مليلتر للحصول على الأوعية الدقيقة المستخرجة من ما يعادل قشرة ونصف لكل أنبوب. ثم ، جهاز الطرد المركزي عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

قبل طلاء الأوعية الدقيقة مباشرة ، خذ قارورتين مطليتين T75 من الحاضنة واستنشق فائض الطلاء. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الأوعية الدقيقة في 1 مليلتر من ECM.

قم بإحضار كل أنبوب إلى 10 ملليلتر مع ECM مكمل ب 4 ميكروغرام لكل ملليلتر من بورومايسين لبدء عملية التنقية وطلاء الأوعية الدقيقة في القارورة.

بعد ذلك ، ضع القوارير في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح بالتصاق الأوعية الدقيقة بمصفوفة الكولاجين والفيبرونيكتين.