تنقية تقارب التكميل ثنائي الجزيئات لعزل بروتينين متفاعلين

لاكتشاف وعزل زوج من البروتينات المتفاعلة المحددة باستخدام تنقية تقارب التكميل ثنائي الجزيئات ، أضف زوجا من خليط البلازميدات ثنائية الجزيئات التكميلية - عامل التعدي في صفيحة مزرعة تحتوي على خلايا الثدييات.

يقوم بلازميد واحد بتشفير بروتين متفاعل واحد - بروتين الطعم - مدمج في جزء من البروتين الفلوري المراسل. يشفر البلازميد الآخر للبروتين المرتبط الآخر - بروتين الفريسة - المدمجة في الجزء التكميلي للبروتين الفلوري.

حضن. يسهل عامل التعدي امتصاص خلايا البلازميد. تعبر الخلايا المنقولة بنجاح عن البروتينات الموضعية لغشاء الخلية.

تفاعلات بروتينات الطعم والفريسة على تقريب شظايا البروتين الفلوريسنت. يؤدي هذا إلى اندماج الشظايا وإعادة طيها ، مما يشكل البروتين الفلوري الوظيفي ، الذي يمكن تصور تألقه تحت المجهر الفلوري.

استبدل الوسائط بمخزن تحلل غير أيوني يحتوي على منظف لتعطيل الأغشية الخلوية ، وإطلاق بروتينات الاندماج. اجمع محللة الخلية في أنبوب. الطرد المركزي.

انقل المادة المطفية المحتوية على بروتين الاندماج إلى أنبوب جديد. أضف حبات الاغاروز المترافقة مع الجسم المضاد أحادي المجال الذي يستهدف البروتين الفلوري ، الجسم النانوي ، والذي يتعرف على حاتمة ثلاثية الأبعاد ويرتبط بها على البروتين الفلوري المطوي.

الطرد المركزي. أعد تعليق حبات الاغاروز المرتبطة ببروتين الاندماج في العازلة. تسخين لفصل بروتينات الاندماج عن حبات الاغاروز. قم بإجراء SDS-PAGE لفصل البروتينات الفردية ، متبوعا بالنشاف الغربي بالأجسام المضادة الخاصة بشظايا البروتين الفلوري.

يتم الكشف فقط عن البروتينات المتفاعلة الموسومة بشظايا الفلورسنت ، مما يؤكد عزلتها.

أولا ، HEK293T البذور الخلايا في أطباق 10 سم تحتوي على 10 ملليلتر من DMEM. بعد ذلك ، قم بتخفيف 2.5 ميكروغرام من كل ناقل تكميل مضان ثنائي الجزيئات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتعدين.

أضف 10 ميكرولترات من كاشف الإرسال ، وقم بتدوير الخليط لمدة 10 ثوان. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات لفترة وجيزة ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، أضف خليط تعداء الحمض النووي إلى الطبق. ثم احتضان العينات لمدة 8 إلى 24 ساعة.

قم بإعداد المخزن المؤقت لتحلل الخلايا والمخزن المؤقت لتحلل الخلايا المكمل كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم اغسل الخلايا باستخدام PBS المثلج مرتين. استنشق PBS ، وأضف 1 مليلتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا المكمل بالثلج.

بعد ذلك ، ضع الطبق على الثلج ، واحتضنه لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، استخدم مكشطة خلية لإزالة الخلايا ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مبرد. الطرد المركزي للأنبوب عند 18,000 مرة من الجاذبية لمدة خمس دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة الحطام الخلوي. ثم انقل المادة الطافية الصافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.

اغسل كمية مناسبة من حبات الاغاروز في 1 مليلتر من PBS. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للحبات عند 300 مرة من الجاذبية ، وقم بإزالة المادة الطافية بعناية. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من حبات الاغاروز إلى كل عينة ، واحتضن عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين مع دوران من طرف إلى طرف.

الطرد المركزي للحبات عند 300 مرة من الجاذبية ، واغسلها في مخزن مؤقت لتحلل الخلية ثلاث مرات. بعد ذلك ، أعد تعليق الخرزات المغسولة في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة المخففة. أخيرا ، سخني العينات على 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق.