اختبار قائم على التألق باستخدام الخلايا الليمفاوية المصممة هندسيا لفحص المركبات المعدلة للمناعة

ابدأ بلوحة متعددة الآبار متوافقة مع الفلورسنت تحتوي على تعليق من الخلايا الليمفاوية التائية المشتقة من الفئران المعدلة وراثيا.

تحتوي هذه الخلايا الليمفاوية على بروتين فلوري أخضر أو كاسيت تعبير GFP ، يتم التحكم فيه عن طريق مستقبل الخلايا التائية أو تفاعل TCR مع المركبات المعدلة للمناعة.

عالج كل بئر بمحلول يحتوي على مركبات معدلة للمناعة ذات إمكانات مختلفة.

أثناء الحضانة ، تتفاعل المركبات المعدلة للمناعة مع TCRs على الخلايا الليمفاوية التائية.

تفاعل TCR مع مركب محفز إلى تنشيط كاسيت الجينات ، مما يؤدي إلى زيادة تعبير GFP.

في المقابل ، فإن تفاعل TCR مع مركب مثبط يثبط كاسيت الجين ويقلل من تعبير GFP.

بعد ذلك ، قم بتراكب الخلايا بصبغة فلورسنت بالحمض النووي لتلطيخ النوى.

الطرد المركزي للوحة لتسوية الخلايا لقياس التألق بدقة.

تحت المجهر الفلوري ، تظهر الخلايا الليمفاوية التائية القابلة للحياة إشارتين مضان تتوافق مع نوى الخلية وبروتينات الفلورسنت الخضراء.

يشير التألق الأخضر المكثف إلى التحفيز الناجح للخلايا الليمفاوية التائية ، بينما تؤكد إشارة التألق الأخضر الخافتة داخل الخلايا التأثير المثبط للمركبات المعدلة للمناعة على الخلايا الليمفاوية التائية.

لفحص الجزيئات الصغيرة عالية الإنتاجية ، قم بوضع 40 ميكرولترا من الخلايا لكل بئر في صفيحة 384 بئرا ، وقم بمعالجة الآبار المناسبة بالدواء أو السيارة المفضلة لفترة العلاج المطلوبة في حاضنة زراعة الخلايا.

قبل 30 دقيقة من تحليل GFP ، قم بتلطيخ الخلايا بالتركيز المناسب من محلول Hoechst ، وتوزيع البقعة جيدا باستخدام ماصة لطيفة. عندما يتم صبغ جميع الآبار ، قم بالطرد المركزي للألواح لجمع الخلايا في قاع الآبار ، واترك الخلايا ترتاح لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

قم بتحميل اللوحة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم قم بتعيين الهدف على 40X أو أعلى. اضبط الكاميرا رقم 4 لمصباح الأشعة فوق البنفسجية ثم اضبط الكاميرا رقم 1 لليزر 488. قم بتحميل اللوحة على نظام الفحص عالي المحتوى. بعد ذلك ، قم بتعيين نظام الفحص الآلي متحد البؤر عالي المحتوى لقراءة 6 إلى 10 حقول لكل بئر ، مع قراءتين متتابعتين لكل حقل عند 488 نانومتر وضوء الأشعة فوق البنفسجية.