اختبار لإشارات عامل النسخ NF-кB/AP-1 المعتمدة على TLR في الضامة

خذ أنابيب تحتوي على البلاعم المراسلة مع جين الفوسفاتيز القلوي الجنيني المفرز أو إنزيم SEAP تحت محفز محفز.

في أنبوب واحد ، أدخل جسما مضادا خاصا بالبلاعم المستقبل الشبيه بtoll-like Toll 2 أو TLR2 ، مما يؤدي إلى تحييد نشاطه.

في حالة أخرى ، أضف مثبطا لقمع إشارات TLR4. اترك الأنبوب الأخير دون علاج.

خذ شريحة مجمعة بطبقة ممتصة من الأنماط الجزيئية المرتبطة بالتلف أو DAMPs - البروتينات التي يتم إطلاقها أثناء نخر الخلية.

أضف البلاعم المعالجة وغير المعالجة في آبار منفصلة واحتضنها.

يرتبط TLR2 و TLR4 على البلاعم غير المعالجة ب DAMPs ، مما ينشط عوامل النسخ العامل النووي - kappa-B ، أو NF-κB ، والبروتين المنشط -1 ، أو AP-1.

تنتقل هذه إلى النواة وترتبط بمحفز SEAP ، مما يؤدي إلى تنظيم إنتاج SEAP ، الذي يتم إفرازه خارج الخلية.

انقل المادة الطافية المحتوية على SEAP إلى صفيحة دقيقة ذات ركيزة كروموجينيك.

SEAP بتحلل الركيزة ، مما ينتج عنه منتج أرجواني أزرق اللون. قياس الامتصاص.

تحييد TLR2 بشدة من إنتاج SEAP ، مما يشير إلى TLR2 كوسيط أساسي.

لتقييم تأثيرات طبقة البروتين الممتصة على نشاط NF-kB / AP-1 بوساطة المستقبلات الشبيهة بالحصيلة ، بعد زراعة البلاعم المراسلة في قارورة بحجم مناسب إلى التقاء 70٪ ، افصل الخلايا بمحلول تفكك إنزيمي مناسب كما هو موضح.

أعد تعليق الخلايا بتركيز 7.3 × 10⁵ خلايا لكل مليلتر في وسط الفحص وتقسيم الخلايا بالتساوي بين ثلاثة أنابيب. عالج الأنبوب الأول من الخلايا بميكروغرام واحد لكل مليلتر من مثبط TLR4 لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. عالج الأنبوب الثاني ب 50 ميكروغراما لكل مليلتر من الجسم المضاد ل TLR2 لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، واترك الأنبوب الثالث في درجة حرارة الغرفة دون معالجة.

أثناء احتضان الخلايا ، أضف 200 ميكرولتر من المحللات و 10٪ مصل بقري الجنين إلى ثلاثة آبار لزجة لكل حالة. اسمح للبروتينات بالامتصاص عند 37 درجة مئوية للفترة التجريبية المناسبة قبل شفط محاليل البروتين بماصة باستور جديدة لكل بئر ، وغسل أسطح الآبار اللاصقة ثلاث مرات ب 250 ميكرولتر من PBS لكل بئر ، لمدة 5 دقائق لكل غسلة.

في نهاية علاج البلاعم المراسل ، أضف 200 ميكرولتر من محلول الخلية إلى كل بئر. أضف Pam3CSK4 إلى التركيز النهائي البالغ 150 نانوغرام لكل مليلتر إلى بئرين كعنصر تحكم إيجابي TLR2 كما هو موضح في التخطيطي.

للحصول على تحكم إيجابي ل TLR4 ، أضف عديد السكاريد الدهني إلى التركيز النهائي البالغ 1.5 ميكروغرام لكل مليلتر إلى بئرين. بعد 20 ساعة عند 37 درجة مئوية ، قم بإضافة 20 ميكرولترا من المادة الطافية من كل بئر في طبق مكون من 96 بئرا ، بما في ذلك ثلاثة آبار بها 20 ميكرولترا من وسط الفحص لكل بئر التحكم في الخلفية.

بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من كاشف فحص مراسل SEAP إلى كل بئر ، وقم بتغطية اللوحة بختم لاصق لمدة 2 و 1/2 ساعة عند 37 درجة مئوية. انقل ما تبقى من المادة الطافية إلى أنبوب واحد سعة 1.5 ملليلتر لكل بئر لزج ، وقم بترسيب الحطام عن طريق الطرد المركزي. بعد ذلك ، قم بنقل المواد الطافية إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 مليلتر لتخزين 80 درجة مئوية تحت الصفر لتحليل السيتوكين المسبب للالتهابات بواسطة ELISA. في نهاية الحضانة ، قم بإزالة الختم اللاصق من اللوحة واقرأ الامتصاص على قارئ اللوحة عند 635 نانومتر.