طريقة التألق المناعي لقياس تحييد الفيروس المضخم للخلايا البشري

خذ التخفيفات التسلسلية للأجسام المضادة الخاصة بالفيروس المضخم للخلايا البشرية ، أو HCMV.

عند إضافة HCMV ، ترتبط الأجسام المضادة بالبروتين السكري B على الغلاف الفيروسي ، مما يؤدي إلى تحييد الفيروس.

انقل الخليط إلى الخلايا الليفية البشرية واحتضنها.

يرتبط مركب البروتين السكري المعالج على الفيروسات غير المعادلة بمستقبلات خلوية محددة ، مما يؤدي إلى اندماج غشاء مضيف الفيروس بوساطة البروتين السكري B وإطلاق نوكليوكابسيد الجينوم المحتوي على الحمض النووي في الداخل.

يدخل الجينوم الذي تم إصداره إلى النواة ، ويرمز البروتينات الموضعية النووية في وقت مبكر على الفور ، أو IE.

يمنع تحييد الأجسام المضادة دخول الفيروس إلى الخلايا.

إزالة الفيروسات غير الداخلية. عالج بالإيثانول عند درجة حرارة دون الصفر لإصلاح الخلايا وتنفاذها.

أدخل جسما مضادا أساسيا يرتبط ببروتينات IE.

أضف جسما مضادا ثانويا مترافقا بالفلوروفور يرتبط بالجسم المضاد الأساسي وصبغة فلورية ترتبط بالحمض النووي.

تحت المجهر ، اكتشف الخلايا الملطخة المزدوجة المصابة بالفيروسات. احسب النسبة المئوية للخلايا المصابة لتحديد تحييد الفيروس عند تركيزات الأجسام المضادة المختلفة.

في اليوم السابق للتجربة ، قم بإعداد الخلايا المستهدفة للعدوى عن طريق زراعة الخلايا الليفية ، التي تزرع في وسط كامل ، تتكون من DMEM مكمل بنسبة 10٪ FBS ، في طبق معقم مكون من 96 بئرا.

بعد 24 ساعة ، قم بإعداد خليط الأجسام المضادة للفيروس عن طريق إضافة 90 ميكرولترا من محلول الأجسام المضادة المخفف في آبار صفيحة جديدة مكونة من 96 بئرا. تحضير التخفيفات التسلسلية لمحلول الأجسام المضادة باستخدام وسائط كاملة.

بالإضافة إلى ذلك ، أضف 60 ميكرولترا من محلول الفيروس ، المخفف مسبقا في وسائط كاملة ، في كل بئر يحتوي على أجسام مضادة لتوليد تركيزات مختلفة من مخاليط الفيروس والأجسام المضادة واحتضانها.

الآن ، لإصابة الخلايا المستهدفة ، خذ الصفيحة المغطاة بالخلايا الليفية. أضف 100 ميكرولتر من تركيزات مختلفة من خليط الفيروس والأجسام المضادة إلى الخلايا ، واحتضن اللوحة المستهدفة لمدة 24 ساعة.

بعد 24 ساعة ، للكشف عن العدوى الفيروسية باستخدام التألق المناعي ، قم بإصلاح الخلايا بالإيثانول المطلق واحتضانها في فريزر -20 درجة مئوية. بعد التثبيت ، تابع الخطوات اللاحقة على مقعد المختبر.

ماصة 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي لجميع آبار اللوحة. ضع الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة.

قم بإزالة محلول الجسم المضاد الأساسي من الآبار. أضف مزيجا من الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور ومحلول DAPI إلى جميع الآبار. احتضن الطبق لمدة ساعة في الظلام ، واغسل اللوحة.

لتحديد العدوى ، تصور اللوحة تحت المجهر ، واحصل على صور باستخدام القناتين الزرقاء والحمراء. احسب النسبة المئوية للإصابة لكل بئر ، كما هو مفصل في البروتوكول النصي.