الاستفادة المثلى من الكمية الصغيرة تحييد الفحص

توضح هذه الدراسة القائم على التصوير مقايسة تحييد الدقيقة لتحليل العلاقات بين المستضدات الفيروسات. بروتوكول توظف الماسحة الضوئية المسطحة، ولها أربع خطوات، بما في ذلك المعايرة، الكميات المعايرة، تحييد، والكميات التعادل. الفحص يعمل بشكل جيد مع الحالي تعميم الأنفلونزا A (H1N1) pdm09، A (H3N2)، والفيروسات B.

العام من اختبار التحييد الدقيق هذا هو توصيف جميع أنواع فيروسات الأنفلونزا المنتشرة الحالية ونشاط الأجسام المضادة والقياسات المضادة للفيروسات بطريقة كمية وعالية الإنتاجية وشديدة الحساسية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الفيروسات ، مثل التوصيف المستضد لفيروسات الأنفلونزا ، والتحييد الكمي للأجسام المضادة ، والأنشطة المضادة للفيروسات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها ميزت جميع الخلايا المصابة ، بما في ذلك اللويحات المرئية وغير المرئية ، والتهابات الخلية الواحدة.

وسيعرض الدكتور ييبو لين، المدير المساعد للمركز المتعاون مع منظمة الصحة العالمية المعني بالإنفلونزا في لندن، اختبار التحييد الدقيق. مستوى السلامة البيولوجية ، أو BSL ، للبروتوكول التالي هو BSL 2 لفيروسات الأنفلونزا الموسمية و BSL 3+ لفيروسات الأنفلونزا الجائحة المحتملة. للبدء ، قم بتقسيم خلايا كافية إلى 96 لوحة بئر.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة يومين إلى ثلاثة أيام للوصول إلى التقاء. باستخدام 70٪ من الإيثانول ، قم بتعقيم غسالة الألواح متعددة الآبار ، واستخدم PBS أو VGM لشطفها. بعد ذلك ، استخدم 200 ميكرولتر من وسط نمو الفيروس ، أو VGM ، لغسل الخلايا المتقاربة.

استنشق VGM من الخلايا ، وأضف على الفور 50 ميكرولترا من VGM إلى كل بئر. بعد ذلك ، أضف 900 ميكرولتر من VGM إلى كل أنبوب من الأنابيب الستة المعقمة. ثم ، قم بإدخال 100 ميكرولتر من الفيروس في الأنبوب الأول واخلطه جيدا.

قم بإعداد التخفيفات التسلسلية للفيروس بدءا من الأنبوب الأول ، وتغيير الأطراف بين كل تخفيف. أضف 50 ميكرولترا من كل تخفيف للفيروس بدءا من أعلى تخفيف لتكرار الآبار من لوحة 96 بئرا. ثم ضع اللوحة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات للسماح للفيروس بإصابة الخلايا.

بعد تحضير التراكب وفقا لبروتوكول النص ، قم بإزالة اللقاح من الآبار. ثم أضف 200 ميكرولتر من التراكب إلى كل بئر ، واحتضن عند 37 درجة مئوية طوال الليل دون إزعاج. أضف 200 ميكرولتر من الثلج البارد 4٪ PFA في PBS A إلى الآبار ، واحتضن عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة أو درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

بعد الحضانة ، قم بشفط PFA ، واستخدم 200 ميكرولتر لكل بئر من PBS A لغسل اللوحة مرتين. أضف 100 ميكرولتر من مخزن النفاذية إلى اللوحة ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم استخدم PBS A لغسل الطبق مرتين.

بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا لكل بئر من الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر ضد الأنفلونزا من النوع A إلى الآبار ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة مع الرج لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، استخدم 300 ميكرولتر من محلول الغسيل لغسل البئر ثلاث مرات. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من الجسم المضاد الثانوي للماعز المترافق HRP إلى العينات ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

بعد غسل الآبار ثلاث مرات كما كان من قبل ، أضف 50 ميكرولترا من الركيزة لكل بئر ، واحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أو حتى يظهر اللون الأزرق بوضوح. لإيقاف التفاعل ، استخدم 200 ميكرولتر من الماء المقطر لغسل الآبار مرتين. ثم ، بعد تجفيف اللوحة بالهواء ، قم بتخزينها في مكان مظلم.

ضع لوحة بئر في منطقة المسح الضوئي للماسح الضوئي المسطح، باستخدام حد الموضع على شكل حرف L لضمان إمكانية الحصول على موقع تصوير مثالي وقابل للتكرار. امسح اللوحة ضوئيا باستخدام الإعدادات الموضحة هنا. بعد ذلك ، قم بتشغيل برنامج قارئ لوحة البئر لحساب تركيز الفيروس المطلوب بالنقر فوق تحميل صورة زر لتحميل صورة.

بعد ذلك، في علامة التبويب العتبة العامة، حرك الشريط الأحمر في الرسم البياني لضبط عتبة أخذ العينات. ثم انقر فوق الزر "تحديث" لفحص التأثير على الصورة. الآن، ضع علامة في مربع حساب التحييد/المعايرة بالتحليل الحجمي.

انقر فوق الزر أخذ العينات لتحديد عدد الخلايا المصابة أو برنامج المقارنات الدولية. ثم عندما يطلب منك ذلك ، انقر فوق حفظ زر لحفظ نتائج أخذ العينات. للحصول على نتائج المعايرة بالتحليل الحجمي، قم بتحميل أو إدخال خريطة تعريف لوحة البئر.

في المعايرة بالتحليل الكيميائي: يشير عدد الفيروسات الأمثل إلى العتبة. حدد علامة التبويب عملية المعايرة بالتحليل الحجمي لحساب نتائج المعايرة بالتحليل الحجمي. بعد ذلك، تحقق من نتائج المعايرة بالتحليل الحجمي قبل النقر فوق حفظ وإغلاق زر لحفظ النتائج.

راجع الملحق S1 للحصول على تعليمات أكثر تفصيلا للبرنامج. لإجراء تحييد الفيروس ، قم بإعداد طبقة أحادية الخلية قبل يومين أو ثلاثة أيام. ثم أضف 50 ميكرولترا من VGM إلى كل بئر من اللوحة.

استخدم العمودين 11 و 12 للتحكم في الفيروسات والتحكم في الخلايا على التوالي. أضف 50 ميكرولتر من واحد من كل 20 تخفيف من إنزيم تدمير المستقبلات ، أو RDE ، المصل المعالج إلى الصف الأول من الأعمدة من واحد إلى 10. قم بإجراء تخفيفات تسلسلية مزدوجة عن طريق نقل 50 ميكرولترا من الصف A إلى الصف H والتخلص من 50 ميكرولترا من الصف H ، ثم أضف 50 ميكرولترا من المادة المخففة إلى كل بئر من عمود التحكم في الخلية.

أضف 50 ميكرولترا من الفيروس إلى كل بئر من اللوحة ، باستثناء عمود التحكم في الخلية. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات. ثم قم بإزالة اللقاح وأضف التراكب إلى كل بئر.

احتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية دون إزعاج. بعد ذلك ، قم بإصلاح الألواح وصخها كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو. لتحديد القياس الكمي ، ضع لوحة بئر في منطقة المسح الضوئي للماسح الضوئي المسطح كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو.

امسح اللوحة ضوئيا وقم بتشغيل برنامج قارئ لوحة البئر لحساب العيارات الفيروسية المطلوبة كما كان من قبل. بعد تحميل أو إدخال خريطة لوحة البئر ، في تحييد: خصم العدوى ، يشير إلى العتبة. ثم حدد عملية التحييد لحساب العيار.

أخيرا ، تحقق من العيار ، وانقر فوق حفظ وإغلاق زر لحفظ نتائج التحييد. تظهر هنا نتائج المعايرة بالتحليل الحجمي من تجارب توصيف المستضدات الحديثة لثمانية فيروسات مدخلة مع تخفيفات تتراوح بين 1.0 في 10 إلى سالب واحد و 1.0 في 10 إلى سالب ستة. يوضح الرسم البياني أن برامج المقارنات الدولية تنخفض مع زيادة تخفيف الفيروس.

تم تطبيع المنحنيات ضد برامج المقارنات الدولية لنفس الفيروسات التي أسفرت عن عدوى في جميع الخلايا داخل البئر. المدرجة في هذا الجدول هي تخفيفات الفيروس التي أنتجت 30٪ من تشبع برنامج المقارنات الدولية والتي تم اختيارها كتخفيف للفيروس المدخل للتحييد. يوضح هذا الشكل نتائج تجربة تحييد باستخدام فيروس إدخال واحد ضد خمسة مضادات الأصل.

الرسم البياني عملية العدوى مع زيادة تخفيف المصل. يمثل السكان الإيجابيون الطبيعيون على المحور الرأسي نسبة ICPs من استجابة الأمصال المقابلة مقابل متوسط برنامج المقارنات الدولية للفيروس المرجعي. أخيرا ، تم تحديد عيارات التحييد على أنها متبادلات التخفيفات المضادة للمصل المقابلة لتقليل ICP بنسبة 50٪.

يركز هذا الاختبار على الاتساق والسرعة وحساسية الكشف، بما في ذلك المعايرة بالتحليل الكمي لفيروسات الإدخال والتصوير عالي الإنتاجية ومعالجة البيانات. إنه فعال من حيث التكلفة وسهل الاستخدام وقد تم استخدامه بشكل روتيني في دراسات المستضدات الفيروسية.