قياس الإنفلونزا تحييد ردود الأجسام المضادة للفيروسات A(H3N2) في الأمصال البشرية قبل درياقي فحوصات باستخدام خلايا مدكك-SIAT1

العام من اختبار التحييد الدقيق هذا هو قياس استجابات الأجسام المضادة المعادلة لفيروسات الأنفلونزا H3N2 المعاصرة في الأمصال البشرية باستخدام خلايا MDCK-SIAT1. يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الرئيسية لتقييم مناعة الأنفلونزا. فعلى سبيل المثال، يمكن أن يحدد ما إذا كان التطعيم ضد الأنفلونزا يحفز استجابات كافية للأجسام المضادة المعادلة لفيروسات H3N2 المنتشرة، للوقاية من العدوى.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم خلايا MDCK-SIAT1 ومقايسات التحييد الدقيق للكشف عن استجابات الأجسام المضادة لإعادة ضبط المجموعات المستضدية لفيروسات الأنفلونزا H3N2. يجب نشر مخزونات الفيروسات إلى عيار معدي مرتفع قبل استخدامها في فحوصات التحييد الدقيق. ابدأ هذا الإجراء بانتشار فيروسات AH3N2 في خلايا MDCK-SIAT1 ، كما هو مفصل في بروتوكول النص.

في اليوم الأول ، قم بإذابة قارورة من الفيروس في درجة حرارة الغرفة ، ثم ضع الفيروس على الفور على الجليد. لاختبار الفيروس عند تخفيفين مختلفين ، أضف أولا 100 ميكرولتر من الفيروس إلى 99 مل من مخفف الفيروس للتخفيف المسبق بنسبة 10: 2. ثم أضف 1 مليلتر من التخفيف المسبق بنسبة 10: 2 إلى 9 ملليلتر من مخفف الفيروس للتخفيف المسبق بنسبة 10: 3.

باستخدام لوحين من الميكروتيتر ، أضف 100 ميكرولتر من المخفف الدقيق إلى جميع الآبار ، باستثناء العمود الأول من لوحة الميكروتيتر 96 بئر. بعد ذلك ، قم بإجراء 10 تخفيفات نصف سجل. أضف 146 ميكرولترا من الفيروس الذي يبدأ التخفيف إلى جميع الآبار في العمود الأول ، وانقل 46 ميكرولترا بشكل متسلسل من العمود الأول إلى العمود الحادي عشر.

قم بتغيير أطراف الماصة بين الأعمدة. بعد خلط العمود الحادي عشر ، تخلص من الأطراف بتخفيف 46 ميكرولتر. استخدم العمود الثاني عشر كعنصر تحكم في الخلية الذي يحتوي فقط على مخفف الفيروسات.

ثم احتضان اللوحة لمدة ساعة واحدة ، عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بإعداد خلايا MDCK-SIAT1 كما هو موضح في بروتوكول النص. أضف 100 ميكرولتر من الخلايا المخففة إلى كل بئر من ألواح الميكروتيتر.

وتغطية اللوحات. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، لمدة 18 إلى 20 ساعة. في اليوم الثاني ، قم بإجراء ELISA ، عن طريق إزالة الوسط أولا من ألواح الميكروتيتر.

بعد غسل كل بئر ب 200 ميكرولتر من PBS ، أضف 300 ميكرولتر من الأسيتون البارد بنسبة 80٪ إلى كل بئر. واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم قم بإزالة المثبت.

واترك الألواح تجف في الهواء. بعد ذلك ، قم بتخفيف الجسم المضاد أحادي النسيلة للبروتين النووي المضاد للإنفلونزا A إلى التركيز المستهدف في مخفف الجسم المضاد. اغسل الأطباق ثلاث مرات باستخدام 300 ميكرولتر من محلول الغسيل.

ثم أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المخفف إلى كل بئر. احتضان الألواح في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. لإضافة الجسم المضاد الثانوي ، قم بتخفيف IgG المضاد للفأر الماعز المترافق مع الجسم المضاد HRP إلى التركيز المستهدف في مخفف الجسم المضاد.

اغسل الأطباق ثلاث مرات باستخدام 300 ميكرولتر من محلول الغسيل. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف إلى كل بئر ، قبل احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، اغسل الأطباق خمس مرات باستخدام 300 ميكرولتر من محلول الغسيل.

واضغط على منديل خال من النسالة. أضف 100 ميكرولتر من الركيزة المعدة حديثا إلى كل بئر. واحتضان في درجة حرارة الغرفة حتى يشبع تطور اللون وتكون الكثافة البصرية أو OD لآبار التحكم في الخلية أقل من 0.2.

ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول التوقف إلى جميع الآبار. اقرأ OD للآبار عند 490 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي المجهري. احسب TCID50 للفيروس باستخدام طريقة Reed-Muench كما هو موضح في بروتوكول النص.

في اليوم الأول من فحص MN ، قم بإذابة المصل في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وإزالته مباشرة بعد الذوبان. قم بتسخين وتنشيط المصل البشري لمدة 30 دقيقة في حمام مائي بدرجة حرارة 56 درجة مئوية ، كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم ضع المصل على الجليد وأضف مخفف الفيروس إلى المصل لتحقيق تخفيف مسبق بنسبة 1:10.

للاختبار باستخدام فيروس واحد ، أضف 50 ميكرولترا من مخفف الفيروس إلى الصفوف من B إلى H ، باستثناء العمودين 11 و 12. ثم أضف 100 ميكرولتر من الأمصال المخففة 1:10 إلى الأعمدة A1 إلى A10. قم بإجراء تخفيف تسلسلي مزدوج من الصفوف من A إلى H.وتخلص من آخر 50 ميكرولترا في الصف H.للسيطرة على الفيروس ، أضف 50 ميكرولترا من مخفف الفيروس إلى الآبار A12 و B12 و C12 و D12.

للتحكم في الخلية ، أضف 100 ميكرولتر من مخفف الفيروس إلى الآبار E12 و F12 و G12 و H12. بالنسبة لمصل التحكم ، أضف 100 ميكرولتر من مصل التحكم المخفف إلى العمود 11 بئر. وأضف 50 ميكرولترا من مخفف الفيروس إلى الآبار من B11 إلى H11.

تابع التخفيف التسلسلي. غطي الأطباق واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، حتى تصبح جاهزة لإضافة الفيروس. لإضافة الفيروس ، قم بتخفيف الفيروس إلى 100 TCID50 في 50 ميكرولتر مع مخفف للفيروسات.

أضف 50 ميكرولترا من الفيروس المخفف إلى جميع الآبار، باستثناء العمود 11 على ألواح المعايرة بالتحليل الحجمي الخلفي وآبار التحكم في الخلية، E12 وF12 وG12 وH12 على جميع الألواح. أضف 50 ميكرولترا من مخفف الفيروس إلى جميع الآبار في العمود 11. ثم أضف 50 ميكرولترا من الفيروس عند 100 TCID50 في 50 ميكرولترا إلى البئر الأول.

بعد ذلك ، قم بخلط ونقل 50 ميكرولترا إلى آبار متتالية لإجراء تخفيفات تسلسلية مزدوجة. قم بتغيير أطراف الماصة بين الآبار لتجنب ترحيل الفيروس. تخلص من 50 ميكرولتر من البئر H11.

ثم أضف 50 ميكرولترا من مخفف الفيروس إلى العمود 11 ليصل الحجم النهائي إلى 100 ميكرولتر. اضغط على اللوحات للخلط. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، لمدة ساعة واحدة ، قبل إجراء إضافة خلايا MDCK في اليوم الأول و ELISA في اليوم الثاني ، كما كان من قبل.

بعد إضافة الأجسام المضادة الأولية والثانوية ، كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بإجراء إضافة الركيزة وقراءة اللوحة. اغسل الأطباق خمس مرات باستخدام 300 ميكرولتر من محلول الغسيل واضغط على منديل خال من النسالة. أضف 100 ميكرولتر من ركيزة العيادات الخارجية المعدة حديثا إلى كل بئر.

بعد ذلك ، قم باحتضان الألواح في درجة حرارة الغرفة حتى تصل آبار التحكم في الفيروس إلى كثافة بصرية عند 490 نانومتر بين 0.8 إلى 3 مع التحكم في الخلية عند OD منخفض في الخلفية أقل من 0.2. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من محلول التوقف إلى جميع الآبار. اقرأ OD للآبار عند 490 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي المجهري.

أخيرا ، حدد عيار الأجسام المضادة المعادلة لكل عينة من عينات المصل ، كما هو موضح في بروتوكول النص. تظهر هنا النتائج التمثيلية لمقايسات التحييد الدقيق. يمثل OD في كل بئر كمية عدوى الفيروس والتكاثر في خلايا MDCK-SIAT1 ، في وجود مصل مخفف بشكل متسلسل يحتوي على أجسام مضادة معادلة.

يتم تعريف قطع التحييد بنسبة 50٪ على أنه متوسط OD لآبار مكافحة الفيروسات بالإضافة إلى متوسط OD لآبار التحكم في الخلايا ، مقسوما على اثنين ، ويعتبر متبادلة أعلى تخفيف للمصل يحقق تحييد مساو أو أكبر من 50٪ عيار الجسم المضاد لعينة المصل. في هذا المثال، تم اختبار الأمصال المزدوجة التي تم جمعها قبل وبعد التطعيم ضد الإنفلونزا من مريضين، ضد فيروس H3N2 المستخدم في اللقاح، خلال موسم الأنفلونزا من 2016 إلى 2017. مع مصل المريض 1 قبل التطعيم ، لم تمنع أي من التخفيفات المصلية الإصابة بالفيروس وبالتالي تعتبر سلبية.

بعد التطعيم ، أظهر المصل من هذا المريض تحييدا. التخفيف الثالث من هذا المصل هو أعلى تخفيف أقل من 50٪ ، وبالتالي فإن هذا المريض لديه عيار ما بعد التطعيم يبلغ 40. وبالمقارنة ، يحتوي المصل من التطعيم المسبق للمريض الثاني على أجسام مضادة معادلة موجودة مسبقا بمعدل عيار 320.

بعد التطعيم ، ارتفع العيار إلى أكثر من 1280. في هذه الحالة ، عند التخفيف المسبق بنسبة 1:10 للمصل ، لم يتم تحقيق عيار نهاية الأجسام المضادة. يمكن إعادة اختبار المصل عند تخفيف مسبق أعلى من أجل تحقيق العيار النهائي.

فحوصات التحييد الدقيق باستخدام خلايا MDCK-SIAT1 حساسة للغاية ومحددة وقوية في الكشف عن استجابات الأجسام المضادة المعادلة للمجموعات المستضدية الحديثة لفيروسات الأنفلونزا H3N2. باستخدام خلايا MDCK العادية ، يمكن أيضا استخدام هذا الإجراء للكشف عن استجابات الأجسام المضادة لسلالات أخرى من فيروسات H3N2 وأنواع فرعية أخرى من فيروسات الأنفلونزا ، لتقييم المناعة الوقائية ضد الأنفلونزا.