التصوير المجهري الإلكتروني للإرسال للالتقام الخلوي المشبكي في الخلايا العصبية في الحصين الفأر

ابدأ بمعالجة الخلايا العصبية في الحصين الفئران بمخزن مؤقت عالي البوتاسيوم يحتوي على بيروكسيداز الفجل الحار أو HRP.

يزيل البوتاسيوم العالي استقطاب الخلايا العصبية قبل المشبكية ، مما يؤدي إلى إفراز الحويصلة المتشابكة. ثم تستعيد الخلايا العصبية أغشية الحويصلة المشبكية من خلال الالتقام الخلوي ، عن طريق دمج HRP في الحويصلات المشكلة حديثا. إصلاح الخلايا العصبية مع الجلوتارالديهايد وغسل لإزالة الجلوتارالديهايد الزائد.

أضف بيروكسيد الهيدروجين والركيزة الملونة ، والتي تتأكسد بواسطة HRP لتكوين رواسب كثيفة الإلكترون. اغسل لإزالة أي ركيزة غير متفاعلة.

تعامل مع رابع أكسيد الأوزميوم لتعزيز تباين الغشاء ، ثم اغسل الكاشف الزائد. بعد ذلك ، أضف أسيتات اليورانيل لتعزيز تباين العضية.

تجفيف الخلايا العصبية باستخدام زيادة تركيزات الإيثانول وتضمينها في الراتنج.

تحديد المناطق كثيفة الخلايا مجهريا واستئصالها. ثم قم بإعداد أقسام رقيقة للغاية.

انقل قسما إلى شبكة نحاسية وقم بمواجهته بعوامل التباين.

باستخدام الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال ، تظهر الحويصلات التي تحتوي على HRP كهياكل كثيفة الإلكترون.

تحفيز ثقافة الخلايا العصبية في الحصين عن طريق إضافة 1.5 مل من محلول التحفيز عالي البوتاسيوم إلى كل بئر في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 ثانية. في هذه الخطوة ، قم بإعداد محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 مولار عند درجة الحموضة 7.4. قم بإصلاح الخلايا باستخدام 4٪ من الجلوتارالديهايد في محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 مولار لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 مولار في كل مرة لمدة سبع دقائق. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول DAB وتصفيته باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر. بعد ذلك ، ضع 1.5 مل من محلول DAB على الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 مولار في كل مرة لمدة سبع دقائق. كتثبيت لاحق ، احتضان الخلايا العصبية ب 1.5 مل من رابع أكسيد الأوزميوم 1٪ في محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 مولار لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية.

بعد ذلك ، اغسل الخلايا العصبية ثلاث مرات باستخدام 1.5 مل من 0.1 مولار كاكوديلات الصوديوم كل مرة لمدة سبع دقائق. بعد ذلك ، قم بإعداد 0.1 مولار من أسيتات الصوديوم مع أسيتات الصوديوم وحمض الخليك الجليدي. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1.5 مل من 0.1 مولر أسيتات كل مرة لمدة سبع دقائق.

بعد ذلك ، احتضان الخلايا ب 1.5 مل من أسيتات اليورانيل 1٪ في عازلة أسيتات 0.1 مولار لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، اغسل الخلايا ثلاث مرات ب 1.5 مل من 0.1 مولي أسيتات عازلة لمدة سبع دقائق في كل مرة. في غطاء الدخان ، قم بتجفيف الثقافة العصبية بغسلات واحدة بسعة 1.5 مللي من الإيثانول بنسبة 50٪ و 70٪ و 90٪ لمدة سبع دقائق لكل غسلة ، تليها ثلاث غسلات مع 1.5 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة سبع دقائق في كل مرة.

بعد ذلك ، قم بإنشاء راتنجات الايبوكسي واخلطها جيدا وتخزينها تحت الفراغ لإزالة فقاعات الهواء. تسلل العينة عن طريق استبدال الإيثانول براتنجات إيبوكسي بنسبة 50٪ في الإيثانول على شاكر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم 70٪ راتنجات الايبوكسي والإيثانول لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر.

قم بتبديل محلول راتنجات الايبوكسي بنسبة 100٪ واحتضانه لمدة 10 دقائق عند 50 درجة مئوية. قم بإجراء تبادلين لراتنجات الايبوكسي الطازجة بنسبة 100٪. يتم احتضان كل تبادل لمدة ساعة واحدة عند 50 درجة مئوية. ثم أضف راتنجات الايبوكسي الطازجة بنسبة 100٪ واتركها تتماسك عند 50 درجة مئوية طوال الليل ثم عند 60 درجة مئوية لأكثر من 36 ساعة.

بعد ذلك ، قم بإزالة كل عينة من اللوحة متعددة الآبار بمنشار صائغ اليدوي. باستخدام مجهر ضوئي مقلوب ، حدد مناطق الاهتمام التي تحتوي على تركيزات كثيفة من الخلايا. ثم قم بقص الكتل المكونة من 4 × 5 × 8 ملليمترات مكعبة للتقسيم. بعد ذلك ، قم بتغطية الأقسام عن طريق الغمر بخلات اليورانيل المائية بنسبة 1٪ لمدة 15 دقيقة ثم 3٪ سترات الرصاص المائي لمدة 5 دقائق لتحسين تباين العينات.