طريقة لتصور وتحليل غشاء متبادلة البروتينات التي نقل المجهر

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور ارتباط بروتين غشاء خارجي على سطح غشاء القرص النانوي عن طريق الفحص المجهري الإلكتروني لنقل البقع السلبية كخطوة أولى نحو تحديد هيكل البروتين عالي الدقة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في العديد من المجالات البحثية لأنها تتعلق بأنشطة البروتين التي تحدث في الأغشية الخلوية وعليها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الأكوام المميزة لأشكال الأقراص النانوية إذا لم يتمكن البروتين من الارتباط بالأغشية.

يمكن رؤية هذه الأكوام بوضوح عن طريق المجهر الإلكتروني للإرسال. يمتد تأثير هذه التقنية إلى تطوير الأدوية حيث يمكن فحص المركبات بسهولة للتأكد من قدرتها على منع أو تمكين تفاعلات البروتين الغشائي على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للظروف المثلى لارتباط البروتين الأحادي بغشاءك ، إلا أنها توفر أيضا بنية منخفضة الدقة لمركب القرص النانوي للبروتين.

لبدء الإجراء ، قم بإخراج وتنقية بروتين السقالات الغشائية مثل MSP1E3D1. بعد ذلك ، باستخدام حقنة زجاجية بإبرة معدنية ، قم بتوزيع 305 ميكرولتر من 25 ملليغرام لكل ملليلتر من POPC في الكلوروفورم في قارورة زجاجية مستديرة القاع. تبخر الكلوروفورم تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين في غطاء الدخان.

جفف الدهون المتبقية طوال الليل في مجفف فراغ. ثم قم بإذابة كعكة الدهون المجففة في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت القياسي MSP المخصب ب 100 مللي مولار كولات الصوديوم كمنظف. دوامة الخليط حتى يصبح شفافا للحصول على تعليق 50 مللي مولار من POPC في المخزن المؤقت.

بعد ذلك ، اغسل خمسة جرامات من الخرزات الكارهة للماء مع 30 مل من الميثانول 100٪ ثم ب 40 مل من الماء عالي النقاء وأخيرا ب 10 مل من المخزن المؤقت القياسي MSP. قم بتخزين الخرزات في أقل من 15 مل من المخزن المؤقت القياسي عند أربع درجات مئوية. ثم امزج 190 ميكرولترا من محلول 0.124 مليمولار من MSP1E3D1 و 61.5 ميكرولتر من معلق 50 مليمولي من POPC في المخزن المؤقت مما ينتج عنه نسبة واحدة إلى 130 مولار من MSP إلى POPC وتركيز كولات الصوديوم 25 ملليمول.

تختلف النسبة المثالية للدهون لكل MSP مع كل اختيار من نوع الدهون وعدسة MSP ويجب تحسينها للحصول على تحضير متجانس للأقراص النانوية. احتضن الخليط على الثلج الرطب لمدة ساعة. ثم أضف المحلول إلى أنبوب يحتوي على 0.5 جرام من الفاصوليا الكارهة للماء المغسولة لكل مليلتر من خليط إعادة التكوين لبدء التجميع الذاتي للقرص النانوي.

احتضان الخليط على أربع درجات مئوية لمدة 16 ساعة بسبع إلى ثماني دورات في الدقيقة. بعد الحضانة ، اسمح للحبات بالاستقرار عن طريق الجاذبية. قم بإزالة المادة الطافية وتخزينها عند أربع درجات مئوية حتى تصبح جاهزة لإجراء كروماتوغرافيا استبعاد الحجم.

قبل الكروماتوغرافيا لاستبعاد الحجم ، قم بالطرد المركزي للخليط عند 13،000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. صب المادة الطافية وتخلص من الحبيبات. قم بموازنة عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم مع المخزن المؤقت القياسي MSP حتى يصبح خط الأساس عند 280 نانومتر مستقرا.

حقن المادة الطافية على العمود واجمع المنتج في كسور 0.5 ملليلتر. قم بقياس امتصاص الكسور عند 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية. احسب تركيز الأقراص النانوية باستخدام معامل الانقراض المولي ل MSP المختار.

لإجراء الرحلان الكهربائي للهلام غير المتغير، قم أولا بخلط 15 ميكرولترا من العينة مع خمسة ميكرولترات من المخزن المؤقت للتحميل المناسب. املأ خزان الكاثود بمخزن كاثود خفيف وخزان الأنود بمخزن مؤقت للتشغيل. قم بتحميل العينة على جل Bis-Tris من أربعة إلى 16٪ وابدأ الجري.

تلطخ الجل حسب تعليمات الشركة المصنعة للجل. لبدء تحضير مركب بروتين أحادي القرص النانوي مع خمسة ليبوكسيجيناز كبروتين ، قم بإعداد دفعة من المخزن المؤقت القياسي MSP المخصب بكلوريد الكالسيوم 1.5 ملليمول. شفط وتنقي بروتين 5LO.

قم على الفور بإعداد خليط 100 ميكرولتر من 0.8 ميكرومولار 5LO و 0.8 micromolar nanodiscs في مخزن مؤقت قياسي MSP غني بالكالسيوم. مثالنا من [مونوتوبيك] بروتيناز خمسة [ليبوكسيجنز] يعتمد على كالسيوم كميات أن يربط إلى غشاء. 5LO حساس للغاية ويجب استخدامه في غضون ساعات قليلة من التحضير.

احتضن الخليط على الثلج لمدة 10 دقائق. قم بتخزين عينة مركب البروتين النانوي الناتجة عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. لبدء التحضير لتحليل TEM ، قم بإذابة جرام واحد من ملح الصوديوم phosphotungstate في 50 مل من الماء عالي النقاء في درجة حرارة الغرفة.

اضبط درجة الحموضة في المحلول على 7.4 بمحلول مولي واحد من هيدروكسيد الصوديوم. قم بتصفية محلول الصوديوم phosphotungstate من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر وقم بتخزين المحلول في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، تفريغ توهج شبكة نحاسية مطلية بالكربون 400 لمدة 20 ثانية عند 30 مللي أمبير لجعل سطح الشبكة محبا للماء.

ضع ما بين 2.5 وخمسة ميكرولترات من عينة مركب البروتين أحادي القرص النانوي على الشبكة واترك العينة لمدة 30 ثانية. ثم استخدم ورق الترشيح لمسح المحلول الزائد من الشبكة. ضع على الفور قطرة من محلول الصوديوم phosphotungstate واترك المحلول لمدة 30 ثانية.

امسح المحلول الزائد واترك الشبكة تجف في الهواء. إجراء الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال بجهد متسارع من 120 إلى 200 كيلو فولت. استبعاد الصور التي تعرض مكدسات طويلة من معالجة الصور اللاحقة.

بالنسبة للصور المحددة ، استخدم طرق المعالجة القياسية لتحديد متوسطات الفئة وإنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد منخفض الدقة للبروتين أحادي القرص النانوي. باستخدام هذه الطريقة ، تم تحضير الأقراص النانوية الفارغة بنسبة واحدة إلى 130 من بروتينات السقالات الغشائية إلى الدهون. لوحظت ذروة رئيسية واحدة فقط أثناء الكروماتوغرافيا لاستبعاد الحجم ولوحظ نطاق واحد فقط في الرحلان الكهربائي للهلام الأصلي الأزرق.

عندما تتم معالجة الأقراص النانوية الفارغة بمحلول ملح الصوديوم phosphotungstate ، يتم تحفيز التكديس. يمكن بعد ذلك ملاحظة هذه الأكوام الطويلة بواسطة TEM. لم يتعطل هذا التكديس بسبب إدراج أيونات الكالسيوم في محلول القرص النانوي قبل تطبيق محلول الصوديوم الفوسفوتونغستات.

عندما يرتبط بروتين أحادي مثل خمسة ليبوكسيجيناز بسطح القرص النانوي ، يتم إعاقة التكديس بسبب الانسداد الدهني بواسطة البروتين. يتوفر كلا جانبي القرص النانوي للربط مما يسمح بتكوين مجمعات الأقراص النانوية 5LO. أظهرت عينة من مجمعين إلى واحد من مجمعات الأقراص النانوية 5LO تراسا أقل من عينة واحدة إلى عينة واحدة.

ربط 5LO وجود أيونات الكالسيوم. تم تأكيد ذلك من خلال ملاحظة التكديس في خليط من 5LO والأقراص النانوية بدون الكالسيوم مما يشير إلى أن 5LO لم يرتبط بأسطح الغشاء. بمجرد تحضير البروتين الأحادي والأقراص النانوية ، يمكن إجراء تقييم ارتباط البروتين بالغشاء في فترة ما بعد الظهر إذا تم إجراؤه بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم تقدير مساحة البروتين على القرص النانوي لاختيار طول MSP الصحيح. بالنسبة للأحجام المتطابقة جيدا ، قد يربط بروتينان خارجيان إلى حد أقصى واحدا على كل جانب من جوانب القرص. من المهم أيضا استخدام ملح الصوديوم من phosophotungsten للحامل السلبي لضمان أقصى تكديس حيث يتم تأكيد الارتباط من خلال مقارنة عدم وجود مداخن بالأكوام الطويلة للعينة بدون بروتين أحادي.

يتيح استخدام الأقراص النانوية بدلا من الجسيمات الشحمية استخدام تشتت الضوء الديناميكي ، وتشتت الأشعة السينية بزاوية صغيرة للإجابة على أسئلة إضافية حول حجم تجانس العينة أو التركيب الجزيئي. يمكن أن يكون الهيكل ثلاثي الأبعاد منخفض الدقة لبروتين غشاء أحادي الارتباط بقرص نانوي خطوة أولى يسهل الوصول إليها في الطريق إلى بنية عالية الدقة لتلك البروتينات المرتبطة.