الفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي لتصور الأحداث الغريبة

ابدأ بطبق ذو قاع زجاجي يحتوي على خلايا عصبية قشرية جنينية في مرحلة تألق الانعكاس الداخلي الكلي أو مرحلة مجهر TIRF.

تعبر هذه الخلايا العصبية عن بروتين فلوري أخضر حساس للأس الهيدروجيني أو علامة حوصلة تحمل علامة GFP تتألق في درجة الحموضة خارج الخلية المحايدة ولكنها تظل غير فلورية في الحويصلات الحمضية.

عند اندماج الحويصلة مع غشاء البلازما ، يؤدي التعرض لدرجة الحموضة خارج الخلية إلى التألق ، مما يشير إلى حدث الإفراز الخلوي.

حدد الهدف واضبط معامل الانكسار لمطابقة الخلايا العصبية.

قم بتوجيه شعاع الليزر بزاوية إلى الزجاج ، مما يتسبب في انعكاس داخلي كامل ويولد موجة زائلة. تثير هذه الموجة بشكل انتقائي علامات GFP بالقرب من غشاء البلازما.

اضبط عمق اختراق TIRF لاستبعاد علامات GFP فوق المجال الزائل.

أولا ، استخدم إضاءة التألق العريض لتحديد موقع الخلايا العصبية التي تعبر عن GFP.

بعد ذلك ، قم بالتبديل إلى إضاءة TIRF للإثارة الخاصة بالغشاء.

احصل على صور بفاصل زمني لتسجيل حدث اندماج الحويصلة وتصور إفراز الخلايا.

بعد إعداد مجهر TIRF والعينة والعثور على مستوى بؤري عصبي وفقا لبروتوكول النص ، ابدأ تشغيل برنامج الليزر واتصل ببرنامج التحكم بالليزر. اضبط الإضاءة على مجال واسع، وحدد الهدف. ثم اضبط معامل الانكسار للعينة ، واضبط شدة الليزر عن طريق إلغاء تحديد TTL لليزر 491.

تحسين معلمات التصوير أمرا مهما أثناء تصوير الحويصلات الخارجية السليمة للأرضية لتجنب انجراف التركيز والسمية الضوئية أثناء إنتاج صور ذات نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية كافية للتحليل.

اضبط شريط التمرير على 100، ثم أخرجه إلى قيمة تتراوح بين 20 و40. ثم أعد التحقق من TTL. بعد ذلك ، ركز على العينة مرة أخرى في إضاءة الضوء المرسلة.

ثم في برنامج التصوير ، حدد إضاءة الليزر 491 ، وافتح الغالق. ضع المكثف رأسا على عقب على المقعد البصري حتى لا تخدش العدسة. اضبط النقطة المحورية لليزر على السقف.

ومع إزالة المكثف ، قم بتوسيط النقطة في مركز غشاء المجال المغلق. ثم استبدل المكثف. وفي برنامج TIRF ، اضبط عمق الاختراق على 110 نانومتر. ثم قم بالتبديل من إضاءة المجال الواسع إلى وضع إضاءة TIRF للتصوير.

الآن ، باستخدام تألق التألق واسع المجال ، ابحث عن خلايا VAMP2 التي تعبر عن الفلورين من خلال العينين. ثم لتقليل التبييض الضوئي والسمية الضوئية ، اضبط معلمات التصوير لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء والنطاق الديناميكي إلى أقصى حد باستخدام الحد الأدنى من وقت التعرض وشدة الليزر. تعيين ضبط تلقائي للصورة مستمر لكل خلية. ثم احصل على مجموعة صور بفاصل زمني مع الاستحواذ كل 0.5 ثانية لمدة 5 دقائق.