الفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي لتصور الأحداث الغريبة

ابدأ بطبق ذو قاع زجاجي يحتوي على خلايا عصبية قشرية جنينية في مرحلة تألق الانعكاس الداخلي الكلي أو مرحلة مجهر TIRF.

تعبر هذه الخلايا العصبية عن بروتين فلوري أخضر حساس للأس الهيدروجيني أو علامة حوصلة تحمل علامة GFP تتألق في درجة الحموضة خارج الخلية المحايدة ولكنها تظل غير فلورية في الحويصلات الحمضية.

عند اندماج الحويصلة مع غشاء البلازما ، يؤدي التعرض لدرجة الحموضة خارج الخلية إلى التألق ، مما يشير إلى حدث الإفراز الخلوي.

حدد الهدف واضبط معامل الانكسار لمطابقة الخلايا العصبية.

قم بتوجيه شعاع الليزر بزاوية إلى الزجاج ، مما يتسبب في انعكاس داخلي كامل ويولد موجة زائلة. تثير هذه الموجة بشكل انتقائي علامات GFP بالقرب من غشاء البلازما.

اضبط عمق اختراق TIRF لاستبعاد علامات GFP فوق المجال الزائل.

أولا ، استخدم إضاءة التألق العريض لتحديد موقع الخلايا العصبية التي تعبر عن GFP.

بعد ذلك ، قم بالتبديل إلى إضاءة TIRF للإثارة الخاصة بالغشاء.

احصل على صور بفاصل زمني لتسجيل حدث اندماج الحويصلة وتصور إفراز الخلايا.

بعد إعداد مجهر TIRF والعينة والعثور على مستوى بؤري عصبي وفقا لبروتوكول النص ، ابدأ تشغيل برنامج الليزر واتصل ببرنامج التحكم بالليزر. اضبط الإضاءة على مجال واسع، وحدد الهدف. ثم اضبط معامل الانكسار للعينة ، واضبط شدة الليزر عن طريق إلغاء تحديد TTL لليزر 491.

يعد

تحسين معلمات التصوير أمرا مهما أثناء تصو