الحقن التجسيمي للنواقل الفيروسية لإعادة برمجة الخلايا الدبقية في نموذج الفأر

قم بتأمين فأر معدلة وراثيا مخدر في إطار تجسيمي مع مكشوفة جمجمته.

يعبر هذا الفأر عن Cre recombinase في الخلايا الدبقية.

ضع الذراع التجسيمية التي تمسك الأنبوب الشعري فوق الجمجمة وقم بمحاذاة الأنبوب فوق البرجما.

اضبط المحاور التجسيمية للاستهداف الدقيق.

احفر حفرة في الموقع المستهدف ، مع التأكد من بقاء الأم الجافية سليمة. إزالة شظايا العظام.

اغسل الأنبوب الشعري بالعازلة. ارسم فقاعة هواء ، ثم قم بتحميل الفيروس المرتبط بالغدة الذي يحمل جينات إعادة برمجة الخلايا العصبية غير النشطة وبروتين الفلورسنت.

اخفض الأنبوب الشعري إلى العمق المستهدف وحقن المحلول الفيروسي في المنطقة الغنية بالخلايا الدبقية.

اسحب الأنبوب بعناية لمنع التدفق العكسي.

أغلق الشق واسمح بالتعافي.

الفيروسات الداخلية بتوصيل الجينات المعطلة المحاطة ب loxP إلى النواة الدبقية. Cre recombinase يقلبها ، وينشط جينات إعادة برمجة الخلايا العصبية ويقود التحويل العصبي. تعبر الخلايا العصبية الداخلية المعاد برمجتها عن البروتين الفلوري تحت المحفز الخاص بالخلايا العصبية.

لحقن عوامل إعادة البرمجة ، ضع فأرة مخدرة في الإطار التجسيمي ، وقم بإدارة التسكين المناسب في بداية الجراحة ، ثم أحضر طرف الشعيرات الدموية الزجاجية لإبرة الحقن فوق بريجما مباشرة. تأكد من أن الطرف الشعري مستقيم تماما في كل من طائرات AP و ML. أعد تعيين كل من قيم M-L و AP إلى 0.0 على عداد الإحداثيات الرقمية.

للتأكد من أن رأس في وضع مسطح تماما ، استخدم عداد الإحداثيات الرقمي لقياس قيمة إحداثيات D-V عندما يكون ذراع AP عند زائد 2.0 وناقص 2.0 ، وكذلك عندما يكون ذراع M-L عند زائد 2.0 وناقص 2.0. اضبط ارتفاع قضيب الأسنان وقضبان الأذن وفقا لذلك. بعد ذلك ، ارفع المحقنة قليلا وحفر حفرة باستخدام مثقاب الأسنان عند إحداثيات الحقن.

ابدأ في الحفر في الموقع ، والعمل بطريقة دائرية ولطيفة. ثم ضع قطعة من الشاش القطني فوق الشق المفتوح واغسل المحقنة بمحلول ملحي. بعد التنظيف ، ارسم فقاعة هواء ثم 1 ميكرولتر من المحلول الذي يحتوي على الناقل الفيروسي. تأكد من إمكانية تصور المحلول الفيروسي بسهولة أسفل فقاعة الهواء.

بعد ذلك ، قم بخفض المحقنة ، وتقدم ببطء إلى العمق المطلوب وتأكد من أن المسار خال من شظايا العظام. بعد ذلك ، قم بحقن 1 ميكرولتر من المحلول الفيروسي بمعدل 0.4 ميكرولتر في الدقيقة. عند الانتهاء من الحقن ، اترك دقيقتين للانتشار قبل سحب المحقنة.

بعد الانتشار ، اسحب المحقنة ببطء حتى يتم سحب طرف الشعيرات الدموية تماما من الدماغ. ثم قم بخياطة الشق بعناية وإزالة من الإطار التجسيمي. راقب في محطة ما بعد الجراحة حتى يستعيد وعيه.

يتم الاحتفاظ بالحيوانات لمدة تصل إلى 12 أسبوعا بعد حقن الفيروس للسماح للخلايا الدبقية المقيمة بإعادة برمجتها إلى خلايا عصبية ناضجة.