في الموقع التهجين لتوطين دقيقة من النصوص في النباتات
نوفمبر 23, 2011
و في الموقع بروتوكول التهجين الموصوفة هنا يسمح للتوطين المباشر مرنا والصغيرة تعبير الحمض النووي الريبي على المستوى الخلوي مع حساسية عالية وخصوصية. هو الأمثل لإجراء البارافين جزءا لا يتجزأ من أقسام الأنسجة النباتية ، ينطبق على طائفة واسعة من النباتات والأنسجة ، ويمكن أن تكتمل في غضون عشرة أيام.
الهدف العام من التجربة التالية هو تصور أنماط تعبير mRNA على المستوى الخلوي بحساسية وخصوصية عالية. يتم تحقيق ذلك عن طريق أخذ أقسام الأنسجة الرسمية والثابتة والبارافين من خلال سلسلة من الحلول لإزالة الشمع الذي يتخلل الأنسجة ومنع المجموعات الصغيرة الموجبة الشحنة في الأنسجة التي يمكن أن تنتج إشارة خلفية. بعد ذلك ، يتم تسلل مجسات الحمض النووي الريبي المسمى DIG الخاصة بالجين المعني إلى أقسام الأنسجة ويتم تهجين الشرائح بين عشية وضحاها.
بعد ذلك ، يتم التعامل مع الشرائح باستخدام الحمض النووي الريبي. A لإزالة المسبار غير المرتبط على وجه التحديد من الأقسام ثم تحضنه بجسم مضاد مضاد ل DIG. يسمح ذلك بتصور المسبار المهجن بواسطة تفاعل كيميائي متري لوني.
تظهر النتائج إشارة زرقاء داكنة يمكن اكتشافها عن طريق الفحص المجهري الضوئي على وجه التحديد في تلك الخلايا داخل الأنسجة التي يتم التعبير عن الجين المعني بها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية لتحليل التعبير الآخر ، مثل R-T-P-C-R أو الأشعة الدقيقة أو نهج تسلسل الجيل التالي هي أن بروتوكول التهجين الأول الموضح هنا يكشف عن نمط التعبير عن جين ذي أهمية في سياق الأنسجة. تتضمن هذه الأساليب العديد من الخطوات التي يتم تعلمها بشكل أفضل من خلال العروض التوضيحية المرئية.
سنوضح كيفية تقسيم الأنسجة وتضمينها بالإضافة إلى الخطوات الرئيسية في بروتوكول Al Hybridization pro التي يصعب إتقانها بنفسك. تختلف طريقة تضمين الأنسجة الثابتة من الباريالديهايد اعتمادا على نوع الأنسجة المراد تحليلها. النقطة الأكثر أهمية هنا هي التأكد من توجيه العينات بشكل صحيح للتقسيم لاحقا.
تتمثل إحدى طرق التضمين في استخدام القوالب والحلقات البلاستيكية. لبدء هذا الإجراء ، قم بتسخين القوالب على لوح تسخين 60 درجة مئوية ثم صب البارافين المنصهر في القوالب. بعد ذلك ، استخدم ملقطا دافئا لنقل عينة من الأنسجة إلى كل قالب وتوجيهها إلى الموضع المطلوب.
انقل القالب بحذر من اللوحة إلى المقعد وضع الحلقة البيضاء على القالب. أضف المزيد من المول والشمع. دع الشمع يبرد ويتصلب تدريجيا قبل التقسيم.
قم بتسخين الكتل إلى درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بقص كل كتلة إلى شكل شبه منحرف ، مع ترك حوالي ملليمتر واحد من الشمع حول العينة. ضع الكتلة المشذبة على الميكروتوم بحيث يكون أطول الوجهين المتوازيين في الأسفل. قم بإحضار الكتلة بعناية إلى الشفرة وتأكد من أن سطح الكتلة مواز لقسم الشفرة.
بسمك ثمانية إلى 10 ميكرون. قم بمحاذاة شرائط الشمع على سطح غير لاصق ، مثل رقائق الألومنيوم وحدد الأقسام ذات الأهمية تحت نطاق التشريح. بعد ذلك ، ضع علامة على الشرائح بالقلم
الرصاص.لا تستخدم الأقلام على العلامات لأنه سيتم مسحها أثناء بروتوكول التهجين الثاني INI. وزعي ملليلتر واحد من ماء مللي كيو النظيف على كل شريحة. تطفو بعناية الأقسام ذات الأهمية على سطح الماء في درجة حرارة الغرفة.
تأكد من أن الجانب اللامع يواجه الماء. انقل الشريحة ببطء إلى جهاز تسخين الشرائح. ضبط على 35 إلى 37 درجة مئوية.
يمنع نطاق درجة الحرارة هذا على عكس 42 درجة مئوية شائعة الاستخدام تكوين الفقاعات تحت الأقسام. بعد خمس دقائق ، اسكب الماء بعناية ولكن بحركة واحدة سلسة بحيث يتم إنزال الشريط لأسفل على الشريحة. اترك الشرائح تجف لعدة ساعات على الأقل أو طوال الليل عند 37 درجة مئوية حتى تلتصق الأنسجة بإعداد أقسام الأنسجة.
بالنسبة للتهجين في الموقع ، يتم إعادة ترطيبها أولا لوضع اللمسات الأخيرة على ديبا. احتضان الشرائح في تغييرين من محلول شفاف لمدة 10 دقائق لكل منهما. لإعادة ترطيب أقسام الأنسجة ، مرر الشرائح عبر سلسلة من التركيزات المتناقصة من الإيثانول لمدة 30 ثانية لكل منها.
أثناء العلاج بالبروتياز ، الذي لم يظهر في هذا الفيديو ، قم بإعداد طبق زجاجي بمحلول أمين ثلاثي 0.1 مولار وقم بإعداده على طبق تحريك في غطاء الدخان. مباشرة قبل وضع رف الانزلاق المعدني في المحلول ، أضف 1.25 مل من أنهيدريد الخليك في أمين الترياتلون والمخزن المؤقت والسلالم. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإعداد نظام التثبيت والوقوف لحمل رف الشرائح.
قلل سرعة Starr ، قم بتثبيت رف الانزلاق على الحامل وقم بخفض الحامل في المحلول ، مع إبقائه مرتفعا فوق قضيب التقليب. استمر في التقليب ببطء لمدة 10 دقائق بعد شطفه في PBS وتجفيفه مرة أخرى من خلال سلسلة الإيثانول. أقسام الأنسجة جاهزة للتهجين.
ضع الشرائح على سطح نظيف واترك الهواء يجف تماما لمدة خمس إلى 10 دقائق. قم بإعداد خليط المخزن المؤقت لتهجين المسبار عن طريق إضافة المسبار المشوه إلى 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين. لكل شريحة ، اخلطي جيدا عن طريق سحب العينات بالإضافة إلى ذلك ، وتجنب صنع الفقاعات.
ماصة المخزن المؤقت لتهجين المسبار. امزج على الحافة اليمنى للشريحة. قم بخفض زلة الغطاء تدريجيا على الشريحة ، مع التأكد من أن محلول التهجين يغطي جميع الأقسام دون أي فقاعات.
اضغط على قصاصة الغطاء برفق بإصبعك حيث تتشكل الفقاعات لإزاحتها من جميع أقسام الأنسجة. لا تسحب قصاصة الغطاء لأن ذلك سيؤدي إلى إتلاف الأقسام. ضع الشرائح في غرفة رطوبة تحتوي على ورق واتمان مبلل بماء UE ومغطى إلى حد كبير بالبارام.
أغلق الصندوق بإحكام واحتضان الشرائح عند درجة حرارة التهجين المطلوبة ، عادة من 50 إلى 55 درجة مئوية لمدة 16 إلى 20 ساعة. عند الانتهاء من بروتوكول التهجين ، قم بإزالة زلات الغطاء بعناية من الشرائح. قد تسقط زلة الغطاء ببساطة عند وضع الشريحة في وضع مستقيم ، ولكن إذا لم يكن الأمر كذلك ، فلا تسحب زلة الغطاء لأن ذلك سيؤدي إلى إتلاف الأقسام.
بدلا من ذلك ، اغمر الشريحة في 0.2 مرة SSC دافئة لمدة دقيقة أو دقيقتين لغسل انزلاق الغطاء بعد إزالة زلات الغطاء ، ضع الشرائح في رف واغسلها عدة مرات في 0.2 مرة SSC عند 55 درجة مئوية. بعد العلاج بالحمض النووي الريبي ، قم بنقل الشرائح من الرف إلى قاع صندوق بلاستيكي مسطح وتغطيته بأقل حجم من محلول الحظر. قم بسد الشرائح لمدة 45 دقيقة من درجة حرارة الغرفة على منصة تهتز ببطء.
بعد ذلك ، ضع حجما ضئيلا من محلول الأجسام المضادة مباشرة على كل شريحة. احتضن الشرائح في الظلام لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة. عند اكتمال الحضانة ، انقل الشرائح إلى صندوق مسطح نظيف واغسل الشرائح أربع مرات بأقل حجم من عازلة الغسيل على منصة اهتزاز في درجة حرارة الغرفة.
اشطف الشرائح مرة واحدة في TBS ومرتين في TN Buffer لتطبيق محلول تلطيخ طازج على الشرائح. أولا ، صب محلول التلوين في طبق وزن بلاستيكي صغير. ثم شطيرة شريحتين مع الأقسام في مواجهة بعضها البعض.
اغمس الساندويتش في المحلول ، مما يسمح للعمل الشعري بسحب المحلول. صفي الشرائح على منديل كيم. املأ الشرائح بمحلول تلطيخ.
مرة أخرى ، قد تحتاج إلى النقر على الشرائح أثناء تدفق المحلول لتجنب الفقاعات ، ووضع الشرائح في صندوق بلاستيكي وتخزين درجة حرارة الغرفة في الظلام. تظهر هنا النتائج التمثيلية التي تم تحقيقها من خلال مجسات مختلفة وأنسجة الأرابيدوبس. توفر الإشارة الأرجوانية تصورا مباشرا بدقة خلوية لنمط التعبير عن الجين محل الاهتمام.
تظهر اللوحة أ توطين نصوص تبادل لاطلاق النار ميلي واحدة في قمة التصوير الخضرية. لاحظ وجود إشارة زرقاء أرجوانية في غير محدد النسيج الإنشائي وعدم وجود إشارة في الأوراق المحيطة. اللوحات B 2D هي أقسام من أجنة مرحلة طوربيد الأرابيدوبسيس حيث يظهر B تعبير كوفاتا ثلاثة في عدد قليل من الخلايا الجذعية الجنينية.
يظهر C تعبيرا واحدا من T ML في طبقة البشرة ، ويظهر D عدم وجود إشارة في الأقسام التي تم فحصها باستخدام RNA سلبي عشوائي. أظهرت هذه الصور التالية نتائج تم الحصول عليها من خلال مجسات مختلفة على أنسجة المتاهة. توضح اللوحة E توطين STM Humalog المعقود في جنين المتاهة النامي.
لاحظ أن الإشارة القوية على وجه التحديد في الأقسام الطولية للجذع والجذر الجنيني من خلال قمة المزلق الخضري تظهر أن ARF ثلاثة A يتم التعبير عنه على سطح الورقة السفلية المحورية في اللوحة F ويتم التعبير عن A T ML ONE HOMOLOG OCL FOUR على وجه التحديد في البشرة. في اللوحة G.As متوقعة ، لم يتم ملاحظة أي إشارة تهجين لمسبار التحكم السلبي في اللوحة H ، والنتائج المتوقعة لنقاط التفتيش المختلفة أثناء النسخ المختبري للمجسات موضحة هنا. يتم فحص مجسات التهجين في الموقع على هلام ARAZ القياسي بعد النسخ في المختبر بعد معالجة الحمض النووي والتنقية اللاحقة لتفاعل النسخ في المختبر بعد التحلل المائي للكربونات وعندما تكون جاهزة للاستخدام في المجسات التي يزيد طولها عن 250 زوجا أساسيا مثل المسبار الأول ، سينتج عن التحلل المائي للكربونات مجموعة من شظايا المسبار الأصغر.
يوضح هذا الشكل نتائج اللون والتأهيل المتري للمجسات عن طريق تخفيفات تحليل اللطخة النقطية التي تتراوح من 10 إلى سالب واحد إلى 10 إلى سالب خمسة من 100 نانوجرام لكل مسبار تحكم ميكرولتر ومن ثلاثة مجسات مسماة DIG تم رصدها حديثا على غشاء نقل محتضن بجسم مضاد ومقايسة مضاد ل DIG. يشير التحليل إلى تركيز يقدر ب 100 نانوجرام لكل ميكرولتر للمسبار اثنين 10 نانوجرام لكل ميكرولتر للمسبار الثالث ونانوجرام واحد لكل ميكرولتر للمسبار الرابع ، مما يشير إلى أنه من غير المرجح أن ينتج عن المسبار الرابع إشارة تهجين جيدة. أخيرا ، توفر هذه المقاطع الطولية من خلال قمة المزلق الخضري من Mace مقارنة بين إشارة خلفية غير محددة ولوحة مسبار تعمل بشكل جيد.
تظهر A إشارة خلفية غير محددة بينما تظهر اللوحة B إشارة تهجين محددة في الموقع لمسبار OC Five في طبقة الخلية الخارجية. بعد مشاهدة هذا ، يجب أن يكون لديك إحساس جيد بكيفية تنفيذ العديد من الخطوات الصعبة في بروتوكولات التهجين init بحيث يمكنك تحديد أنماط التعبير الزمني للضغط الدقيق للمراهقين المفضلين لديك.
النظرة العامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً مفصلاً لتهجين المواقع في الموقع لتصوير أنماط تعبير mRNA في الأنسجة النباتية المغلفة بالبارافين. تم تحسين الطريقة لحساسية وخصوصية عالية، مما يسمح للباحثين بملاحظة التعبير الجيني في سياق الأنسجة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا النبات
- تحليل التعبير الجيني
الخلفية
- يتيح التهجين في الموقع تحديد موقع mRNA و RNA الصغيرة.
- البروتوكول قابل للتطبيق على أنواع مختلفة من الأنسجة النباتية.
- يوفر طريقة لتصوير أنماط التعبير الجيني مباشرة.
- الحساسية والخصوصية العالية هي المزايا الرئيسية لهذه التقنية.
غرض الدراسة
- لتصوير أنماط تعبير mRNA على المستوى الخلوي.
- لتوفير طريقة موثوقة لتحليل التعبير الجيني في الأنسجة النباتية.
- لإظهار مزايا التهجين في الموقع على طرق تحليل التعبير الأخرى.
الطرق المستخدمة
- تحضير أقسام الأنسجة المغلفة بالبارافين.
- تغلغل مسبار RNA المسمى DIG في أقسام الأنسجة.
- تهجين المسابير والتصوير من خلال تفاعلات لونية.
- استخدام محاليل غسل وحجب محددة لتقليل الإشارة الخلفية.
النتائج الرئيسية
- تمت ملاحظة إشارات زرقاء داكنة في الخلايا التي تعبر عن الجين محل الاهتمام.
- كشفت الطريقة أنماط تعبير الجينات داخل سياق الأنسجة.
- تم تحقيق التصوير الناجح باستخدام المجهر الضوئي.
- يمكن إكمال البروتوكول في غضون عشرة أيام.
الاستنتاجات
- بروتوكول التهجين في الموقع فعال لدراسة التعبير الجيني في النباتات.
- يوفر ميزة واضحة على طرق أخرى مثل RT-PCR وميكروأري.
- تحضير العينات المناسبة وتوجيهها أمر بالغ الأهمية لنجاح التقسيم.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Precise spatial localization of gene transcripts in plant tissues is critical for de-risking target validation and understanding gene function in developmental and stress-response pathways. In situ hybridization enables high-resolution mapping of mRNA and small RNA expression, supporting predictive confidence in early discovery and translational research. This capability strengthens portfolio decisions by clarifying gene activity within relevant cellular contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of gene expression at cellular resolution for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by revealing spatial and temporal expression patterns in situ.
- Facilitates hypothesis testing for gene function in developmental and stress-response models.
- Improves predictive confidence for advancing gene targets in plant biotechnology pipelines.
Screening & Assay Development
- Provides validated tissue-based systems for downstream molecular and phenotypic assays.
- Delivers reproducible, quantitative spatial readouts for assay standardization.
- Enables rapid evaluation of multiple gene targets without the need for transgenic lines.
- Supports scalable screening by applying the protocol across diverse plant species and tissues.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene expression data with disease-relevant or stress-response phenotypes in plants.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by confirming endogenous gene activity.
- Reduces risk of false positives by distinguishing specific from background signals in tissue context.
- Supports biomarker identification for translational research in crop improvement and trait development.
Pipeline & Workflow Integration
In situ hybridization fits between early discovery and preclinical validation, bridging high-throughput transcriptomics with spatially resolved expression analysis.
- Discovery Biology: Confirms gene expression hypotheses and clarifies pathway localization in plant tissues.
- Screening: Provides robust, reproducible spatial data to inform downstream functional assays.
- Analytics: Generates quantitative and qualitative readouts for comparing gene expression across conditions and genotypes.
- Translational Research: Links molecular findings to phenotypic outcomes in relevant plant models.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable across plant species and gene targets, supporting broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Standardizes spatial gene expression analysis with high sensitivity and specificity.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and prioritizes targets with validated tissue-specific expression.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of gene targets and traits in plant biotechnology pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue embedding, sectioning, and probe design for optimal results.
- Needs access to microtomy, hybridization, and colorimetric detection infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and data comparability.
- Protocol is adaptable but may require optimization for different plant species or tissue types.
- Signal specificity and background minimization are critical for reliable interpretation.
