Chromosomics: الكشف عن التغيرات العددية والهيكلية في جميع الكروموسومات 24 الإنسان وقت واحد باستخدام رواية الفحص FISH OctoChrome
فبراير 6, 2012
رواية مضان في الموقع تهجين (FISH) الأسلوب الذي يدرس في نفس الوقت تعديلات كروموسوم على حد سواء العددية والهيكلية، ولا سيما translocations محددة الكروموسومات المرتبطة اللوكيميا وسرطان الغدد الليمفاوية، من جميع الكروموسومات 24 الإنسان على جهاز واحد في واحد تهجين،.
يفحص مقايسة Octa Chrome Fish جميع الكروموسومات البشرية الـ 24 في وقت واحد من خلال عملية تهجين واحدة على شريحة واحدة. أولاً، يتم تحضير توزيعات الطور الاستوائي على الشريحة المحددة ذات المربعات الثمانية. بعد ذلك، يتم إجراء مسح آلي لشريحة العينة لتسهيل تحديد مواقع جميع أطوار الاستواء وإعادة تقييم كافة صور الخلايا مستقبلاً.
في الخطوة التالية، يتم وضع الشريحة ذات المربعات الثمانية فوق جهاز Octa chrome وتهجين المجسات. يمكن أن تظهر النتائج التي تم الحصول عليها ثلاثة كروموسومات كاملة مصبوغة بألوان مختلفة في كل مربع بناءً على ترتيب تركيبات الكروموسومات في جهاز RO. لقد خطرت لي فكرة طريقة RO FISH هذه لأول مرة عندما بدأت في تطبيق تقنية FISH في دراسات المجموعات البشرية خلال أوائل التسعينيات.
بعد ذلك، طرحت فكرتي حول الصبغ ثلاثي الألوان، واستخدام شريحة مربعة ثمانية لضبط الخلايا في مؤتمر A A CR السنوي عام 1994. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل ثني الكروموسومات الكلاسيكي والنمذجة الطيفية الحديثة، في قدرتها على تحليل جميع الكروموسومات البشرية البالغ عددها 24 بسهولة في عدد أكبر من الخلايا. ابدأ بتحضير خلايا في الطور الاستوائي مثبتة في معلق كعينة ضابطة، ثم ضع قطرة من الخلايا باستخدام الماصة على شريحة وتحقق من الكثافة المناسبة.
الآن قم بغمس شريحة كروم OC مربعة ثمانية في إيثانول نقي لمدة دقيقتين. وقم بتوزيع 5 µL من معلق الخلايا على شريحة القالب في ترتيب مربعات متبادلة لمنع تداخل مساحات انتشار الخلايا مع بعضها البعض. اترك العينات لتجف في الهواء قبل وضع أزواج متجاورة.
ضع 20 µL من صبغة DAPI بتركيز 0.2 µg/mL في مركز كل نصف من الشريحة، ثم ضع غطاء الشريحة. الآن، قم بإجراء مسح آلي للشريحة العينة لتحديد موقع خلايا الطور الاستوائي. استخدم برنامج metaverse لتسهيل تحديد مواقع جميع الأطوار الاستوائية وإعادة تقييم جميع صور الخلايا مستقبلاً.
قم بمراجعة نتائج المسح يدويًا واحذف الشوائب التي لا تمثل الطور الاستوائي. أولاً، قم بإزالة صبغة DPI في محلول XSSC المنظم بتركيز 2X، ثم قم بتجفيف العينات من خلال سلسلة من غسلات الإيثانول. اترك الشريحة لتجف في الهواء، ثم ضعها على لوح تسخين بدرجة حرارة 37 degree Celsius لمدة خمس دقائق.
الآن، قم بموازنة مسبار chroma، وغرفة تهجين المسبارات المتعددة، ومحلول التهجين المنظم في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C مع توجيه الجانب الذي يحتوي على الملصق إلى الأسفل. ضع جهاز OC chrome على لوح تسخين عند درجة حرارة 37 °C. أضف 2 µL من محلول التهجين المُسخن مسبقاً إلى كل منطقة من المناطق الثماني.
اقلب القالب بدقة ووجهه في الاتجاه الصحيح. مرر جهاز OC chrome فوقه. تحقق من محاذاة شريحة القالب مع جهاز Octa Chrome.
بعد ذلك، أنزل الشريحة بعناية فوق قطرات محلول التهجين، وطبق ضغطاً خفيفاً ومتساوياً لتوزيع محلول التهجين حتى حواف كل منطقة من المناطق المرتفعة في جهاز OC chrome. ارفع الطرف المطفي من الشريحة الزجاجية واقلبها بحيث تصبح الشريحة أسفل جهاز OC chrome. ضعها على لوح تسخين عند درجة حرارة 37 degree Celsius لمدة 10 دقائق.
ثم انقلها إلى لوح تسخين عند درجة حرارة 75 درجة Celsius لمدة خمس دقائق. ولتثبيط طبيعة العينات من أجل خطوة التهجين، انقلها إلى غرفة تهجين chroma probe متعددة المجسات. أغلق الغطاء وضع الغرفة لتطفو في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة Celsius طوال الليل.
أخرج الشريحة بعناية من الجهاز واغسلها باستخدام 0.4 من فائض SC عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين. قم بإجراء الغسلة الثانية في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية. انتقل بعد ذلك لإضافة 20 µL من DPI إلى مركز كل نصف من الشريحة ثم ضع غطاء الشريحة.
يُحضن العينات في الظلام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل فحصها باستخدام مجهر الفلورسنت. يسهّل تحليل Octa chrome fish الفحص المتزامن لجميع الكروموسومات البشرية الـ 24 باستخدام تهجين واحد على شريحة واحدة. يحمل كل مربع ثلاثة مجسات مختلفة لصبغ الكروموسومات الكاملة والموسومة مباشرة بفلورات ذات ألوان مختلفة.
يظهر الفحص الرباعي لخلية في الطور الاستوائي الطبيعي في المربع الثاني من نظام Octa CHRO أن الكروموسومات 8 و21 و12 ملونة باللون الأحمر والأخضر والأزرق. ويمكن رؤيتها بشكل فردي باستخدام المرشحات الخاصة بكل منها، أو رؤيتها بشكل متزامن من خلال مرشح DAPI Fitzy وTexas Red الثلاثي. ويُفيد هذا النهج في دراسة الكروموسومات في الكشف عن الخلايا غير الطبيعية التي تعاني من انتقالات كروموسومية محددة لسرطان الدم، واختلال الصيغة الصبغية.
على سبيل المثال، يُعد T 8 21 انتقالاً صبغياً شائعاً في ابيضاض الدم النقوي الحاد. كما تُعد ثلاثية الصبغي 21 (وجود 3 نسخ من الصبغي 21) من حالات تعدد الصيغ الصبغومية الشائعة في ابيضاض الدم بعد التطور. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للعلماء في مجال الوراثية الخلوية الجزيئية والوبائيات الجزيئية لاستكشاف إعادة الترتيب الصبغي الأكثر شيوعاً المكتشفة في ابيضاض الدم والليمفوما، وفحص تعدد الصيغ الصبغومية الانتقائي بين جميع الصبغيات البشرية لدى المرضى السريريين أو المجموعات السكانية المعرضة للمواد الكيميائية السامة.
بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية فحص جميع الكروموسومات البشرية الـ 24 في آن واحد من خلال عملية تهجين واحدة على شريحة واحدة باستخدام مقايسة Octo Chrome Fish. ونحن نعرف هذه بأنها الكروموسومات.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة جديدة لتهجين الفلورة الموضعي (FISH) تُعرف باسم تحليل Octa Chrome Fish. وتتيح هذه الطريقة الفحص المتزامن لجميع الكروموسومات البشرية الـ 24 في عملية تهجين واحدة على شريحة واحدة، مع التركيز على التغيرات الكروموسومية المرتبطة بمرض اللوكيميا والليمفوما.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- التهجين الموضعي المتألق (FISH)
- التحليل الكروموسومي
- علم الأورام
خلفية علمية
- تُعد تقنية التهجين الموضعي المتألق (FISH) تقنية تُستخدم للكشف عن وجود أو غياب تتابعات محددة من DNA على الكروموسومات وتحديد موقعها.
- تكتسب الانتقالات الكروموسومية أهمية كبيرة في دراسة سرطان الدم والورم اللمفاوي.
- تسمح هذه الطريقة بإجراء تحليل شامل للتغيرات الكروموسومية.
- كانت الطرق السابقة تتطلب عمليات تهجين متعددة، مما يجعل هذا النهج أكثر كفاءة.
الغرض من الدراسة
- لتطوير طريقة تبسّط الكشف عن التشوهات الكروموسومية.
- لتعزيز كفاءة التحليل الكروموسومي في الإعدادات السريرية.
- لتوفير أداة تساهم في فهم أفضل للأساس الجيني للأورام الدموية الخبيثة.
الطرق المستخدمة
- تحضير مستحضرات الطور الاستوائي على شريحة متخصصة ذات ثماني مربعات.
- المسح الآلي للشريحة لتحديد مواقع الأطوار الاستوائية المخصصة للتحليل.
- تهجين المجسات باستخدام جهاز Octa Chrome.
- تصوير النتائج التي تظهر صبغ كروموسومات كاملة مختلفة بناءً على ترتيباتها.
النتائج الرئيسية
- يتمكن هذا الفحص من تصوير جميع الكروموسومات الـ 24 بنجاح في عملية تهجين واحدة.
- يمكن أن تظهر النتائج ثلاثة كروموسومات مصبوغة مختلفة في كل مربع من الشريحة.
- يسهل إعادة تقييم صور الخلايا لإجراء تحليل شامل.
- يوضح إمكانية التطبيق في دراسات المجموعات البشرية.
الاستنتاجات
- يمثل تحليل Octa Chrome Fish تقدماً كبيراً في منهجية التهجين الموضعي المتألق (FISH).
- يمكن لهذه الطريقة تحسين الكشف عن التشوهات الكروموسومية في السرطانات الدموية.
- توفر هذه المنهجية نهجاً أكثر كفاءة للباحثين والأطباء السريريين.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح مقايسة OctoChrome-FISH الكشف المتزامن عن التغيرات الصبغية العددية والهيكلية عبر جميع الكروموسومات البشرية الـ 24 في عملية تهجين واحدة، مما يعالج عقبة رئيسية في التحليل الخلوي الوراثي للأورام الدموية الخبيثة. ومن خلال دمج فحص الجينوم الكامل في سير عمل واحد يعتمد على الشريحة، فإن هذه التقنية تعزز الإنتاجية وقابلية التكرار في أبحاث اللوكيميا والليمفوما، مما يدعم التحقق المبكر من الأهداف وتقليل المخاطر الميكانيكية في مرحلة الاكتشاف قبل السريري. وتعمل هذه القدرة على تحسين الثقة التنبؤية في تحديد الجينات المسرطنة المدفوعة بالانتقال وأنماط اختلال الصيغة الصبغية ذات الصلة بتكون اللوكيميا الناجم عن البنزين والتعرض للمواد السامة الأخرى.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تمكّن من استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال تصور الانتقالات الخاصة بمرض اللوكيميا، مثل t(9;22) وt(15;17) وt(8;21) وt(14;18)، في سياقها الكروموسومي الأصلي.
- القيمة التشغيلية: تقلل من الحاجة إلى إجراء عمليات تهجين FISH متعددة ومتتالية، مما يحافظ على العينات ويسرع تأكيد الهدف في بيولوجيا الاكتشاف.
- القيمة التنبؤية: تدعم فرز محفظة المشاريع من خلال توفير تقييم متزامن لإعادة الترتيب الهيكلي واختلال الصيغة الصبغية على نطاق الجينوم، مما يعزز الثقة في الارتباطات بين الهدف والمرض.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تجهيز أنظمة كروموسومية تم التحقق من صحتها لعمليات الفرز اللاحقة من خلال تحديد النمط النووي الأساسي وكشف معدلات التغير الخلفية في المجموعات المعرضة.
- القيمة التشغيلية: توحيد القراءات الوراثية الخلوية من خلال وسم ثابت للمجسات وبنية موحدة للشرائح، مما يعزز إمكانية التكرار عبر المختبرات وحملات الفرز.
- قيمة القابلية للتوسع: تمكين التحليل عالي المحتوى لانتشارات الطور الاستوائي عبر المسح الآلي، مما يسهل إعادة التقييم والتتبع الطولي للاستقرار الكروموسومي في دراسات علم السموم الطولية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة الترجمية: تسد الفجوة بين مرحلة الاكتشاف والتحقق قبل السريري من خلال السماح بالمقارنة المباشرة للتغيرات الكروموسومية في النماذج الخلوية، وعينات المرضى، والمجموعات السكانية المعرضة للمواد المسببة للوكيميا مثل البنزين.
- تقليل المخاطر الآلية: توضح ما إذا كانت حالات عدم التعدد الصبغي (aneuploidies) أو الانتقالات الملحوظة هي أحداث عشوائية أم أنماط مرتبطة بالتعرض، مما يدعم تقييم المخاطر في تطوير المؤشرات الحيوية الترجمية.
- قيمة الاستمرارية: تدعم الانتقال السلس من النتائج المختبرية (in vitro) إلى الأهمية الحيوية داخل الكائن الحي (in vivo) من خلال الحفاظ على دقة التحليل الكروموسومي عبر أنظمة النماذج والعينات البشرية.
تكاملات سير العمل ومسارات المعالجة
يتناسب هذا الاختبار ضمن التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية، مما يتيح إجراء التحليل الكروموسومي في المراحل المبكرة من اختبار الفرضيات، ويدعم تحديد المركبات الواعدة من خلال الحد من المخاطر الميكانيكية المرتبطة بعدم الاستقرار الجينومي.
- بيولوجيا الاكتشاف: تسهل اختبار الفرضيات المتعلقة بالآليات الكروموسومية في نشوء سرطان الدم من خلال السماح بالفحص المتزامن لتعديلات متعددة، معروفة وجديدة، عبر الجينوم بالكامل.
- الفحص: توفر مخرجات كمية متعددة (على سبيل المثال، تردد الانتقال الكروموسومي، ومعدلات تعدد الصيغ الصبغية) تسمح بمقارنة تأثيرات المركبات أو التعرضات عبر ظروف مختلفة.
- التحليلات: تولد قراءات فلورية متعددة متوافقة مع التصوير الآلي وتحديد النمط النووي بمساعدة البرمجيات، مما يتيح مقارنة موضوعية للحالات الكروموسومية.
- الأبحاث الانتقالية: تربط النتائج المخبرية بالأهمية البشرية من خلال اكتشاف أنماط كروموسومية متطابقة في الدراسات السكانية، مما يدعم مواءمة المؤشرات الحيوية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تعمل كمنصة وراثة خلوية قابلة لإعادة الاستخدام في برامج الأورام وعلم السموم وعلم الصيدلة الجيني التي تتطلب تقييماً لسلامة الكروموسومات.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف عن طريق تقليل السلبيات الكاذبة من خلال التغطية الكروموسومية الشاملة.
- القيمة التشغيلية: تحسن التقييس وقابلية التكرار عبر مجموعات مجسات وتنسيقات شرائح موحدة، مما يقلل من التباين بين المختبرات.
- القيمة الاستراتيجية: تعزز كفاءة رأس المال من خلال تقليل استهلاك الكواشف والوقت المستغرق في العمل اليدوي مقارنة بنهجي FISH أو SKY المتسلسلين.
- التأثير على المحفظة: تتيح اتخاذ قرارات تطوير معدلة حسب المخاطر من خلال توفير أدلة مبكرة على الاستقرار أو عدم الاستقرار الجينومي في المرشحين الرئيسيين.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في المجهر الفلوري والتحضيرات السيتوجينية لضمان التوليد الدقيق لانتشار الطور الاستوائي وتفسير الإشارات.
- يعتمد على توفر جهاز OctoChrome وغرف تهجين متوافقة لإيصال مسابير متعددة في وقت واحد.
- يستلزم توحيد بروتوكولات التعامل مع الشرائح، وعمليات المسخ، والغسل لضمان اتساق تغلغل المسابير ونسب الإشارة إلى الضوضاء.
- قد يتطلب التكيف مع أنظمة النماذج غير البشرية إعادة التحقق من خصوصية المسابير وكفاءة صبغ الكروموسومات.
- تشمل القيود العملية الاعتماد على عينات ذات جودة طور استوائي، واحتمالية تداخل الإشارات في الجينومات ذات إعادة الترتيب العالي، مما يتطلب فكاً طيفياً دقيقاً.
