3D متعدد الألوان أداة الحمض النووي الأسماك لدراسة العمارة النووية في الخلايا الأساسية البشرية

تمثل الـ DNA FISH ثلاثية الأبعاد أداة لتصور اللوية الجينومية المتعددة داخل النوى المحفوظة ثلاثية الأبعاد، مع تحديد تفاعلاتها المتبادلة وتوطينها بشكل لا لبس فيه داخل الفضاء النووي على مستوى خلية واحدة. هنا ، يتم وصف بروتوكول خطوة بخطوة لمجموعة واسعة من الخلايا الأساسية البشرية.

3D متعددة الألوان الحمض النووي FISH تمكن التصور من loci الجينومية متعددة داخل النوى المحفوظة لتعريف غامضة التفاعل المتبادل والتعريب على مستوى الخلية الواحدة. 3D متعددة الألوان FISH الحمض النووي يسمح التحقيق المباشر للهندسة النووية. بشكل عام، يعمل بالاقتران مع التقنيات القائمة على التقاط الكروموسوم مما يجعل هذه التقنية أداة متاحة للتحقق من صحة البيانات C داخل الخلايا المفردة.

إثبات الإجراء سيكون فيديريكا مارسكا. إنها ما بعد الدكتوراه في مختبري تبدأ من خلال احتضان مزيج ترجمة في خلاط الحرارية في 16 درجة مئوية وفقا لطول المواد DNA البداية.

في نهاية الحضانة، والتحقق من حجم المسابير على 2.2٪ agarose هلام. لكل تجربة FISH الحمض النووي، يعجل الكمية المناسبة من التحقيق وفقا لمواد الحمض النووي التي بدأت التي تم إنتاج المسابير في 150 ميكرولترات من الماء المقطر مزدوجة، 20 ميكروغرام من الحمض النووي لسائل السلمون المنوي غير المُسمّى، و3.5 ميكروغرام من أنواع محددة من الحمض النووي Cot-1، وثلاثة مجلدات من الإيثانول بنسبة 100٪، وحجم 1/10 من ثلاثة خلات الصوديوم الضروس لمدة ساعة واحدة عند ناقص 80 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، الطرد المركزي العينة في السرعة القصوى لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية.

بعد التخلص من ناظر، يغسل بيليه مرتين مع 500 ميكرولترات من 70٪ الإيثانول. بعد الغسيل الثاني، resuspend بيليه في اثنين من microliters من 100٪formamide وهز المسبار لمدة 30 دقيقة في 40 درجة مئوية قبل إضافة حجم متساو من 4X ملحي الصوديوم سيترات في 20٪ دكستران كبريتات. لتثبيت قبل المعالجة و Permeabilization من الخلايا الصغيرة مع نواة صغيرة وكمية منخفضة من السيتوبلازم، أولا إضافة مرتين 10 إلى الخلايا السادسة في 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني مباشرة على أغطية الزجاج في آبار فردية من لوحة 24 جيدا والسماح للخلايا لتسوية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

في النهاية من الحضانة, استبدل سريعا ال [بيبس] مع 300 ميكرولترات من طازجة أعدّ 4٪ [كهرفورملديد] يكمّل مع 0.1٪ توين 20. بعد 10 دقائق، قم بغسل الخلايا الثابتة ثلاث مرات في 300 ميكرولترات بنسبة 0.05٪ TPBS لمدة خمس دقائق لكل غسل في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل الأخير ، permeabilize الخلايا التائية مع 300 ميكرولترات من 0.5 ٪ TPBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل علاج الخلايا مع 250 ميكرولترات في بئر من كوكتيل RNAse المخفف 1:100 في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية.

في نهاية الحضانة، شطف الخلايا في 300 ميكروليترات من برنامج تلفزيوني وإضافة 300 ميكرولترات من 20٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني إلى كل بئر مع حضانة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي، ضع الزجاج على الثلج الجاف لمدة 15 إلى 30 ثانية لتجميد الخلايا قبل ذوبان العينات تدريجيا في درجة حرارة الغرفة ونقعها في 300 ميكرولترات من 20٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني لمدة 30 ثانية. بعد تجميد / ذوبان الخلايا ثلاث مرات أخرى كما هو موضح للتو ، وغسل العينات في 300 ميكرولتر من 0.5 ٪ TPBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، تليها اثنين من يغسل في 300 ميكرولترات من 0.05 ٪TPBS لمدة خمس دقائق لكل غسل في درجة حرارة الغرفة.

بعد الغسيل الأخير ، تعامل مع الخلايا مع 300 ميكرولتر من 0.1 حمض الهيدروكلوريك العادي لمدة 12 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، تليها اثنين من الشطف في 300 ميكرولتر من سيترات الصوديوم المالحة. ثم إصلاح العينات بين عشية وضحاها في 300 ميكرولترات من 50٪ formamide في سترات الصوديوم المالحة 2X في درجة حرارة الغرفة. لتثبيت, قبل العلاج و permeabilization من الخلايا الكبيرة مع كمية عالية من السيتوبلازم, إصلاح, قبل علاج و permeabilize الخلايا مماثلة لمثيل لخلايا T الأولية الإنسان وعلاج العينات مع 300 ميكرولترات من 0.0025٪ البيبسين في 0.01 حمض الهيدروكلوريك العادي لبضع ثوان تصل إلى خمس دقائق.

مراقبة الخلايا تحت المجهر البصري ووقف التفاعل مع اثنين من يغسل لمدة خمس دقائق في 300 ميكرولترات من كلوريد المغنيسيوم 50 ملليمولار بمجرد أن تكون النوية خالية من السيتوبلازم ولكن النوكلولي لا تزال مرئية وسليمة. بالنسبة لـ FISH الحمض النووي متعدد الألوان ثلاثية الأبعاد ، يُسخ مسابير التهجين عند 80 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ووضع المسابير على الجليد على الفور. تحميل تحقيقات على شريحة المجهر نظيفة ووضع واحد coverslip من الخلايا على كل قطرة من التحقيق.

ختم حواف الغطاء مع الاسمنت المطاطي. عندما جفف الاسمنت تماما، يُسخ العينات على كتلة تسخين 75 درجة مئوية. بعد أربع دقائق، اغمر العينات بـ 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في صندوق معدني يطفو في حمام مائي.

في صباح اليوم التالي، قشر قبالة الاسمنت المطاطي ومع الشرائح مغمورة في 2X سترات الصوديوم المالحة رفع بعناية قبالة الأغطية. ضع كل غطاء في آبار فردية من لوحة سداسية الآبار تحتوي على ميليلترين من سترات الصوديوم المالحة الطازجة في البئر لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 90 ثورة في الدقيقة. في نهاية الحضانة، شطف الأغطية لفترة وجيزة في مليلترين من 0.2٪ توين 20 في 4X سترات الصوديوم المالحة.

للكشف عن أسماك الحمض النووي متعددة الألوان ثلاثية الأبعاد، قم بنقل الأغطية إلى آبار فردية لصفيحة جديدة من 24 بئرًا ومنع أي ربط غير محدد في 300 ميكرولترات من عازلة الحجب لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية و20 ثورات في الدقيقة. في نهاية الحضانة، علاج العينات مع التركيز المناسب من مضادة للديوكسيجينين و / أو streptavidin المخفف في عازلة سد لمدة 35 دقيقة في غرفة داكنة ورطبة في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، نقل العينات إلى آبار فردية من لوحة ستة آبار وغسل العينات ثلاث مرات في مليلتر من 0.2٪ توين 20 و 4X سترات الصوديوم المالحة لمدة خمس دقائق لكل غسل مع اهتزاز في 90 ثورة في الدقيقة الواحدة.

بعد الغسيل الأخير، توازن العينات في مليلترين من PBS قبل نقل الأغطية إلى لوحة جديدة 24-well لإصلاح ما بعد التثبيت في 300 ميكرولترات من 2٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني في البئر لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا الثابتة خمس مرات لفترة وجيزة في 300 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني، تليها تلطيخ مع DAPI تضعف في نانوغرام واحد لكل ملليلتر في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل الأغطية خمس مرات أخرى في برنامج تلفزيوني وجبل العينات مع وسيلة مناسبة التركيب.

ثم الحصول على صور 3D مع نظام المجهر. 3D متعددة الألوان الحمض النووي FISH يسمح التصور المعاصر من loci الجينومية المختلفة داخل النوى 3D المحفوظة. لإعداد مسبار الحمض النووي، فإن حجم المسبار الذي يقل عن 200 زوج أساسي يضمن إجراءًا متعدد الألوان متعدد الألوان ثلاثي الأبعاد للحمض النووي FISH.

دون المستوى الأمثل الحمض النووي FISH تحقيقات التي تنتجها ترجمة يمكن أن يكون جزئيا أو أكثر من هضمها. على تحقيقات هضم سوف ينتج إشارة غير محددة بسبب خسارة التحديد في التهجين و زيادة بالتالي من الخلفيّة. بالنسبة للخلايا الليمفاوية T الأساسية والخلايا الصغيرة ذات النوى الصغيرة وكمية منخفضة من السيتوبلازم، يوصى بمعالجة حمض الهيدروكلوريك الطبيعي لمدة 12 دقيقة لتعزيز إمكانية الوصول إلى الخلايا النووية لتحقيقات الحمض النووي والحفاظ على السلامة النووية.

لا حاجة له هضم البيبسين السيتوبلازمي للحصول على إشارة جيدة FISH الحمض النووي في الخلايا الصغيرة. بالنسبة ل myoblasts الإنسان الأولية والخلايا التي لديها نواة كبيرة وفيرة السيتوبلازم، ومع ذلك، فإن خطوة البيبسيبلي أمر أساسي. وسوف تعوق البيبتونية الخلوية القصيرة ودون الأمثل إدخال المسبار إلى النوى المنتهية في غياب إشارة FISH للحمض النووي.

ومع ذلك، إذا كانت الخلايا أكثر من pepsinized، لن تبقى النوى سليمة فقدان هيكلها 3D. نجاح 3D متعددة الألوان الحمض النووي FISH سيؤدي إلى وجود إشارة داخل النوى. أقترح العمل مع المواد البيولوجية الطازجة ، واختبار المسابير قبل أداء 3D متعددة الألوان الحمض النووي الأسماك ، وإعداد حلول جديدة ويجري دقيقة مع أوقات الحضانة ودرجات الحرارة.

تذكر أن الفورماميد وHCL هي المواد الخطرة وينبغي دائما أن تستخدم في غطاء الدخان الكيميائية مع المواد القابلة للتصرف المناسبة.