الكشف عن المشترك بين الكروموسومات الزيغ مستقرة من قبل الإسفار متعددة في الموقع التهجين (mFISH) والطيفية تنميط نووي (سكاى) في الفئران المشعع

الهدف العام من هذه الطريقة الجزيئية الخلوية هو مراقبة الانحرافات المستقرة بين الكروموسومات في خلايا نخاع العظام للفئران المعرضة للإشعاع الكلي للجسم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي في مجال بيولوجيا الإشعاع مثل خطر إحداث انحرافات كروموسومية مستقرة في خلايا نخاع العظام للفئران المعرضة لإشعاع الجسم الكلي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتصور الموجه للأضرار الجينية المستقرة الناجمة عن الإشعاع في خلايا نخاع العظام للفئران والتي يمكن أن تنتشر عبر العديد من أجيال الخلايا.

بعد عزل نخاع العظم عن عظم الفخذ وعظام الساق وعمل تعليق خلية واحدة وفقا لبروتوكول النص ، قم بتراكب تعليق الخلية بعناية على حجم متساو من وسط فصل الخلايا أحادية النواة لنخاع العظم. جهاز الطرد المركزي التدرج عند 400 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، اجمع طبقة بافي بعناية دون إزعاج الطبقات المتبقية وانقل المحلول إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل.

لتحضير انتشار الخلايا الطورية ، أضف 10 ملليلتر من PBS إلى الأنبوب الذي يحتوي على طبقة مصفرة. ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 400 مرة G في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية واضغط برفق على الأنبوب لتفتيت حبيبات الخلية.

ثم أضف 10 مل من PBS وقم بالطرد المركزي للتعليق مرة أخرى. قم بإزالة المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخلية. قم بتفتيت الحبيبات وإضافة قطرة بقطرة أربعة ملليلتر من محلول كلوريد البوتاسيوم منخفض التوتر 0.075 مولار مع رج لطيف ومستمر.

احتضان معلق الخلية عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في حمام مائي. ثم أضف حجما متساويا من المثبت إلى الأنبوب واخلطه برفق عن طريق قلب الأنبوب. الطرد المركزي للأنبوب وإزالة المادة الطافية.

ثم قم بتفكيك بيليه الخلية وأضف مثبتا جديدا. كرر الغزل وإضافة المثبت خمس مرات أخرى. بعد إعادة تعليق الخلايا في 400 إلى 600 ميكرولتر من المثبت ، قم بإسقاط 30 ميكرولترا من الخلايا الثابتة على شرائح مبللة ومبللة مسبقا مائلة بزاوية 45 درجة واترك الشرائح تجف تماما طوال الليل.

لإجراء طلاء كروموسوم الفأر بواسطة mFISH ، ضع الشريحة التي تحتوي على خلية الطور ينتشر في 2X SSC لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بتجفيف الشريحة عن طريق الغسيل التسلسلي للإيثانول في 70٪ 80٪ و 100٪ إيثانول لمدة دقيقتين في كل غسلة. سخني 40 مل من محلول التمسخ في وعاء زجاجي إلى 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

ثم انقل الشريحة إلى المحلول الدافئ مسبقا واحتضان العينة لمدة دقيقة إلى 1 1/2 دقيقة لتشويه طبيعة الكروموسومات. استخدم على الفور الإيثانول المثلج 70٪ لإخماد الشريحة لمدة دقيقتين لإيقاف عملية التمسخ ومنع الكروموسومات المشوهة من إعادة التصدير. ثم قم بتجفيف الشريحة باستخدام سلسلة الإيثانول التي تبدأ ب 80٪ من الإيثانول لمدة دقيقتين.

بعد ذلك ، ضع الشريحة في 100٪ من الإيثانول لمدة دقيقتين. ثم جفف الشريحة تماما في درجة حرارة الغرفة. لتغيير طبيعة المسبار ، قم بالطرد المركزي لخليط المسبار الذي توفره الشركة المصنعة لفترة وجيزة ، ثم انقل 10 ميكرولتر إلى أنبوب طرد مركزي بغطاء سعة 500 ميكرولتر واحتضان الأنبوب في حمام مائي عند 80 درجة مئوية لمدة سبع دقائق.

الآن ضع الأنبوب الذي يحتوي على المسبار المشوه في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم ضع خليط المسبار على شريحة بها كروموسومات مشوهة. قم بتغطية المنطقة بعناية بغطاء زجاجي مقاس 18 ملم × 18 ملم وتخلص من أي فقاعات هواء مرئية عن طريق الضغط برفق شديد على الغطاء على الشريحة.

استخدم الأسمنت المطاطي لإغلاق جميع الجوانب الأربعة للغطاء. واحتضان الشريحة في الظلام في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 16 ساعة. بعد التهجين ، قم بإزالة الأسمنت المطاطي والغطاء بعناية وضع الشريحة في 0.4X SSC مسخن مسبقا عند 74 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

ثم انقل الشريحة إلى محلول الغسيل ثلاث مرات لمدة دقيقتين. أضف 20 ميكرولترا من وسيط التثبيت المضاد للبهتان مع صبغة DAPI المضادة على الشريحة وقم بتغطيتها بغطاء زجاجي. استخدم مناديل المختبر للضغط برفق على الغطاء لإزالة أي فقاعات هواء ومحلول تركيب زائد.

ثم استخدم طلاء الأظافر لإغلاق حواف الغطاء. عرض الشرائح باستخدام مجهر الفلورسنت المزود بالمرشحات المناسبة. بالنسبة للتنميط النووي الطيفي لكروموسومات الفأر ، بعد تهجين المجسات على الكروموسومات المشوهة وغسل العينات وفقا لبروتوكول النص ، قم بتطبيق 80 ميكرولترا من كاشف تلطيخ SY5 على الشريحة.

ضع غطاء بلاستيكي مقاس 24 × 60 ملم فوق العينة ، واحتضنه في الظلام في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة. اغمس الشريحة في وعاء زجاجي يحتوي على محلول غسيل مسخن مسبقا واحتضنه في حمام مائي على حرارة 45 درجة مئوية مع رج لمدة دقيقتين. كرر الغسيل ثلاث مرات.

ضع 80 ميكرولترا من كاشف التلوين SY5.5 على العينة ، وقم بتغطيتها بغطاء بلاستيكي مقاس 24 × 60 ملم ، واحتضنه في الظلام في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة. استخدم محلول الغسيل الدافئ مسبقا لغسل الشريحة ثلاث مرات ثم أمسك الشريحة في وضع مائل مقابل منشفة ورقية لتصريف السوائل الزائدة. أضف 20 ميكرولترا من كاشف DAPI المضاد للبهتان إلى العينة وضع غطاء زجاجي بعناية في الأعلى دون إدخال أي فقاعات هواء.

استخدم طلاء الأظافر لإغلاق الحواف ومراقبة العينة باستخدام مجهر epifluorescence المجهز لالتقاط صور السماء. يوضح هذا الشكل انتشارات خلية الطور التمثيلي مع أزواج كروموسومات الفأر الطبيعية والشاذة واحد واثنين وثلاثة. فيما يلي انحراف مستقر يتضمن كروموسوم واحد حيث تم دمج جزء من الكروموسوم الأول في كروموسوم DAPI غير مطلي بينما شكل جزء آخر جزءا غير مركزي.

في هذا المثال ، تم دمج جزء من الكروموسوم الثاني في كروموسوم غير مطلي. يتضمن هذا الانحراف المستقر الكروموسوم الثالث. تظهر الانحرافات المستقرة التي تشمل جميع الكروموسومات الثلاثة المطلية في انتشار الطور هذا.

يظهر هنا مثال على التنميط النووي الطيفي لأنثى فأر عادية. تمثل هذه اللوحة انحرافا مستقرا يشمل الكروموسومات الأربعة و 12. أخيرا ، يتضمن انحراف الكروموسومات المستقر في هذه اللوحة الكروموسوم السابع و 10.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون 48 إلى 72 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه يجب استخدام الخلايا المتكاثرة فقط. يمكن استخدام اتباع هذا الإجراء وطرق أخرى كما هو الحال في النطاق للإجابة على أسئلة إضافية مثل ما إذا كانت الانحرافات المستقرة بين الكروموسومات موجودة في الخلايا المشععة.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الوراثة الخلوية الجزيئي لاستكشاف العلاقة بين الانحرافات الجينية بالأمراض المختلفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فكرة أوضح عن كيفية تحديد الانحرافات المستقرة بين الكروموسومات. لا تنس أن العمل مع الكولشيسين يمكن أن يكون خطيرا للغاية لأنه مادة مسرطنة ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات أثناء إجراء هذه التجربة.