تقييم التعبير GFP واستمرار استخدام يستند إلى صورة طالي عداد الكريات
November 17th, 2011
هذا البروتوكول يصف كيفية تنفيذ بقاء الخلية المقايسات والتعبير مضان باستخدام يستند إلى صورة طالي عداد الكريات.
يوضح هذا الفيديو إجراء لتحديد صلاحية الخلية في الخلايا التي تعبر عن GFP باستخدام مقياس الخلوي القائم على صورة الإحصاء. يتم تلطيخ الخلايا المنقولة GFP باستخدام مجموعة قابلية الإحصاء للخلايا الميتة باللون الأحمر ، والتي تلطخ جميع الخلايا الميتة باللون الأحمر باستخدام يوديد البروبيديوم ، ويتم سحب الخلايا في شريحة تحليل خلوية وتحميلها في مقياس الخلوي ، الذي يكتسب ويحلل الصور الفلورية الحمراء والخضراء الساطعة. ثم يتم إنشاء الرسوم البيانية لعرض عدد الخلايا ، وحجم الخلية ، وكثافة مضان PI ، وشدة مضان GFP عند مقارنتها بقياس التدفق الخلوي التقليدي.
يمكن أن يوفر Tali بيانات مماثلة فيما يتعلق بصلاحية الخلية وتعبيرها. ومع ذلك ، يوفر هذا القياس الخلوي المستند إلى الصور معلومات مرئية إضافية حول مجموعة الخلايا التي يتم فحصها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل قياس التدفق الخلوي أو الفحص المجهري الفلوري هي أن مقياس الخلايا القائم على صورة الحساب يوفر معلومات كمية ومرئية في وقت واحد حول عينة الخلية.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن أداة الحساب أسهل في الاستخدام ، وهي أقل تكلفة ولها بصمة أصغر من مقياس التدفق الخلوي أو المجهر الفلوري. يسمح ذلك للباحثين بإجراء فحوصات كمية بسرعة مثل الجدوى في الخلايا التي تعبر عن GFP على سطح الطاولة. في هذا الإجراء ، تم تحويل خلايا U2 OS بتركيز واحد في 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر مع بنية فيروسية GFP لضوء الخلية المستهدفة نووية للحفاظ على الخلايا الميتة مع يوديد البروبيديوم الذي ينقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
لاحظ أن تركيز واحد في 10 إلى الخامس إلى واحد في 10 إلى الخلايا السابعة لكل مليلتر يوصى به للفحص على الرغم من أن التركيز لا يجب أن يكون دقيقا. بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحد من الكاشف الأحمر للخلايا الميتة. ثم الدوامة لفترة وجيزة للخلط ، واحتضان كاشف التلوين وخليط الخلية في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة دقيقة إلى خمس دقائق.
بعد الحضانة ، انتقل على الفور إلى التحليل على مقياس الخلوي القائم على الصور. يستخدم العدد شرائح تحليل خلوية بلاستيكية يمكن التخلص منها مصممة خصيصا للأداة. تأكد دائما من تثبيت الشريحة من الحواف لتحميل الشريحة.
ماصة 25 ميكرولترا من العينة ببطء في إحدى مناطق تحميل العينات على شكل نصف قمر. هنا ، يتم تحميل خلايا التحكم غير الملوثة غير الملوثة في الغرفة A ويتم تحميل الخلايا المعبر عن GFP الملطخة في الغرفة B.To إجراء اختبار الجدوى في الخلايا التي تعبر عن GFP ، المس G-F-P-R-F-P على الشاشة الرئيسية لمقياس الخلويات. ستظهر خيارات الفحص بعد ذلك على اليمين حدد GFP بالإضافة إلى الجدوى.
ستسأل الأداة بعد ذلك عما إذا كان ينبغي تسمية سلسلة العينة لتسمية سلسلة العينة. اضغط على الاسم الآن. ثم باستخدام شاشة اللمس ، اكتب اسم سلسلة العينة واضغط على حفظ مقياس التعداد الخلوي سيتقدم تلقائيا إلى شاشة القياس.
بعد ذلك ، لقياس تألق الخلفية ، اضغط على علامة تبويب الخلفية في النصف الأيمن السفلي من شاشة القياس كما هو موضح هنا. يشير الإعداد الافتراضي إلى أنه سيتم تصوير تسعة حقول من الخلايا. الآن مع توجيه عينة التحكم بعيدا عن الجهاز ، أدخل الشريحة في منفذ التحميل حتى تتوقف.
لا تضغط بالقوة على شاشة الخلفية التي تعمل باللمس لإدخال عنصر تحكم جديد في الخلية غير ملطخة. سيتم سحب الشريحة تلقائيا إلى الأداة وسيتم عرض صورة حية للخلايا على الشاشة. باستخدام مقبض التركيز البؤري ، قم بإحضار الخلايا إلى مستوى الرؤية المناسب أثناء التركيز.
حرك زر التكبير/التصغير الأحمر إلى أربعة x أو 16 x. لعرض مجموعة الخلايا بشكل أفضل ، يجب أن تكون الخلايا مظلمة بشكل موحد مع هالة ساطعة حول كل منها. كما هو موضح هنا ، قد يتم التقليل من عدد الخلايا عندما يكون الانتقال بين الخلفية وحواف الخلايا غامضا بحيث لا يتم تحديد حدود الخلية جيدا.
قد يتم إفراط في عد الخلايا عندما يكون لها مراكز ساطعة ومحيط مظلم. بمجرد التركيز على الخلايا ، المس ، اضغط لتشغيل التحكم في الخلايا غير الملوثة. لقياس تألق الخلفية ، سيقوم مقياس الخلوي تلقائيا بالتقاط الصور وعرض الصور المصغرة لكل مجال رؤية.
يوفر شريط التقدم تحديثا مستمرا للتحليل. بعد اكتمال التقاط الصورة ، يقوم مقياس الخلوي تلقائيا بإخراج الشريحة ويوفر البيانات من تحليل الصور الملتقطة. يتم عرض البيانات المخزنة في القائمة المنسدلة لعلامة تبويب الخلفية.
سيتم تعيين عينة التحكم في الخلفية بنفس الاسم المعطى للتجربة. لتشغيل عينة GFP الملونة PI ، قم بإزالة الشريحة من الجهاز ، واقلبها وأعد إدخالها مع توجيه العينة المحولة بعيدا عن الجهاز. اضغط على علامة تبويب العينة ثم المس اضغط لإدراج عينة جديدة.
عندما تظهر الصورة على الشاشة ، استخدم مقبض التركيز البؤري لتركيز الخلايا. كما كان من قبل ، ثم المس اضغط لتشغيل العينة. بعد اكتمال التقاط الصورة ، تظهر البيانات من التحليل أسفل علامة تبويب العينة ويقوم مقياس الخلوي تلقائيا بإخراج الشريحة بشكل مناسب.
تخلص من شريحة التحليل الخلوي للحصاء. كنفايات خطرة بيولوجيا ، لا يمكن إعادة استخدام هذه الشرائح. بمجرد تشغيل العينة، يمكن تطبيق العتبات على العينة.
لتحليل مجموعات خلايا معينة هنا، سنضبط العتبات لتحديد النسبة المئوية للخلايا الحية والميتة. في الخلايا المعبرة عن GFP ضمن علامة تبويب العينة ، عدد ونسبة الخلايا التي تعبر عن الخلايا الحية والميتة GFP التي تعبر عن قابلية GFP الإجمالية للبقاء. يتم عرض متوسط حجم الخلية وعدد الخلايا التي تم عدها وتركيز الخلية.
بالإضافة إلى ذلك ، يتم عرض مخططات الرسم البياني التي تعرض حجم الخلية والتألق الأخضر والتألق الأحمر في الجزء السفلي من الشاشة. لتعيين بوابة حجم الخلية، المس الصورة المصغرة لحجم الخلية لفتح الرسم البياني لحجم الخلية لاستبعاد أي حطام. حرك أشرطة التمرير الزرقاء لاستبعاد الأحداث الكبيرة والصغيرة.
المس تطبيق لتضمين الخلايا داخل البوابات. بعد إضافة مضان GFP إلى التحليل ، المس الصورة المصغرة للرسم البياني ل GFP. لفتحه.
حرك شريط التمرير الأزرق لتعيين العتبة على يمين الذروة الأكثر تعتيما. استخدم نموذج التحكم كدليل. يسمح هذا للتحليل بتضمين الخلايا الإيجابية GFP ، ولكن استبعاد الخلايا الفلورية الذاتية.
كثيرا ما يتم ملاحظة التألق الذاتي عندما تكون الجزيئات البيولوجية داخل الخلايا تعمل باللمس بشكل ممتاز للتأكيد والعودة إلى الشاشة السابقة. يجب أن تعكس البيانات المعروضة تحت علامة تبويب العينة الآن البوابات والعتبة المحددة لكلتا قناتي التألق. بعد ذلك ، لفصل خلايا صبغة PI عن التألق الذاتي أو أي خلفية موجودة في العينة ، اضغط على الصورة المصغرة للرسم البياني PI لفتحها مرة أخرى.
سيتم عرض ذروة عينة التحكم كذروة رمادية على الرسم البياني. الذروة الحمراء هي مضان العينة. يتم عرض مضان الخلفية كذروة أقرب إلى قيمة RFU الصفرية على هذا الأداة.
للتخلص من تألق الخلفية في قناة PI، حرك شريط التمرير الأزرق لضبط العتبة. لاستبعاد هذه الذروة، استخدم الذروة الرمادية من عينة عنصر التحكم كمرجع. عندما يتم تعيين الحد في قناة PI بشكل مناسب، المس تطبيق للتأكيد والعودة إلى الشاشة السابقة، ستقوم أداة الإحصاء بإعادة تحليل البيانات تلقائيا مرة أخرى وتحديث النتائج في علامة تبويب العينة.
بعد ذلك ، للتأكد بصريا من تعيين كل خلية بشكل صحيح ، اضغط على علامة التبويب التكبير/التصغير ، ثم حدد مجال رؤية تم التقاطه للمراجعة بالضغط على الصورة المصغرة للصورة. ثم اضغط على علامة تبويب الطبقات. بعد ذلك ، اضغط على زر GFP أو PI لعرض الصورة الملتقطة من خلال تلك القناة.
اضغط على نفس الزر مرة أخرى لإزالة الطبقة من الشاشة أو لتركيب الطبقات ، أزرار اللمس المقابلة لكل قناة لتحديد كيفية حساب الخلايا من خلال قناة معينة. دوائر اللمس الخلايا التي تم عدها من خلال قناة المجال الساطعة فقط ، والتي لا تعبر عن التألق ، سيتم وضعها حول دائرة باللون الأزرق. يشير هذا إلى أن خلية معينة هي خلايا حية تعبر في القناة الخضراء.
سيتم وضع دائرة حول GFP في خلايا خضراء معبرة في القناة الحمراء. سيتم وضع دائرة ملطخة ب pi باللون الأحمر وهي خلايا ميتة يتم احتسابها في كليهما. سيتم وضع دائرة حول القناة الحمراء والخضراء باللون الأصفر.
يشير هذا إلى أن الخلية تعبر عن GFP ولكنها ملطخة أيضا ب pi وبالتالي فهي ميتة. من حين لآخر ستظهر دائرة سوداء على الشاشة. هذه هي الكائنات التي تم تحديدها ولكن تم استبعادها من التحليل بناء على حجم الخلية.
استمر في ضبط العتبة في الرسم البياني الفلوري باستخدام الخطوات الموضحة للتو حتى يتم وضع دائرة حول كل خلية تعبر عن التألق باللون المناسب. يتم حفظ جميع معلمات التحليل تلقائيا على الأداة. أسفل البيانات، انقر فوق الضغط.
يمكن للحصيلة تخزين ملفات البيانات من 500 عينة تشغيل. كل ملف مخزن في علامة تبويب البيانات متاح لإعادة التحليل. من خلال تحديد الملف من علامة تبويب البيانات ، سيتم إعادة فتحه وتصبح جميع الرسوم البيانية والطبقات نشطة لأرشفة البيانات وإنشاء التقارير.
يمكن نقل البيانات المخزنة في الجهاز إلى جهاز كمبيوتر باستخدام محرك أقراص USB. تم نقل أربعة أنواع من الخلايا التمثيلية بضوء خلية مستهدفة نووية ، وبنية فيروسية GFP ملطخة بمجموعة أدوات صلاحية الإحصاء باستخدام كاشف أحمر الخلية الميتة وتحليلها بواسطة العدد في مقياس التدفق الخلوي كما هو موضح هنا. أبلغت كلتا الطريقتين عن نفس النسبة المئوية تقريبا من السكان لكل نوع من الخلايا التي كانت تعبر عن GFP ، جنبا إلى جنب مع النسبة المئوية لإجمالي السكان الذين كانوا قابلين للحياة ويعبرون عن GFP.
توضح هذه البيانات أن مقياس الخلوي Tali قادر على التمييز بين إجمالي تعبير GFP في السكان وتعبير GFP في السكان الأحياء. لقد أوضحنا للتو كيفية استخدام مقياس الخلايا القائم على صورة الحساب لتقييم التعبير الفلوري وقابلية البقاء في عينة الخلية. تعمل هذه التقنية على سد الفجوة بين الدراسات الفردية والدراسات السكانية.
باستخدام مقياس الخلوي المستند إلى صورة الحساب ، يمكنك جمع معلومات مرئية كمية ونوعية حول الخلايا الفردية بالإضافة إلى مجموعات الخلايا الأكبر. باستخدام نفس الإجراء ، يمكن إجراء العديد من المقايسات الأخرى بما في ذلك موت الخلايا المبرمج ، وتعبير RFP ، وصلاحية الخلية بالنسبة للخلايا غير الشفطرة ، تشمل التطبيقات المحتملة تقييم التعبير الجيني لدراسات فعالية الدواء.
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء اختبارات قابلية الخلايا للحياة وتعبير الفلورسنت باستخدام جهاز Tali Image-Based Cytometer. تتيح الطريقة للباحثين تحليل مجموعات الخلايا باستخدام البيانات الكمية والبصرية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- المجهر الفلوري
- قياس الخلايا
الخلفية
- يوفر جهاز Tali Image-Based Cytometer بديلًا لقياس الخلايا بالتدفق التقليدي.
- يسمح بالحصول على البيانات الكمية والبصرية في وقت واحد.
- الطريقة سهلة الاستخدام وفعالة من حيث التكلفة.
- إنها مناسبة لتحليل الخلايا التي تعبر عن GFP.
هدف الدراسة
- لتقييم قابلية الخلايا للحياة في الخلايا التي تعبر عن GFP.
- لإظهار مزايا القياس الخلوي المستند إلى الصور مقارنة بالطرق التقليدية.
- لتوفير بروتوكول مفصل لاستخدام جهاز Tali Image-Based Cytometer.
الطرق المستخدمة
- نقل GFP إلى خلايا U2 OS.
- تلطيخ باستخدام كاشف Tali Dead Cell Red.
- تحميل العينات في شرائح التحليل الخلوي Tali.
- استخدام جهاز Tali Image-Based Cytometer للتحليل.
النتائج الرئيسية
- بيانات كمية عن قابلية الخلايا للحياة وتعبير GFP.
- تمثيل بصري لمجموعات الخلايا.
- رسوم بيانية تظهر حجم الخلايا وكثافة الفلورسنت.
- مقارنة النتائج مع قياس الخلايا بالتدفق التقليدي.
الاستنتاجات
- جهاز Tali Image-Based Cytometer فعال لتقييم قابلية الخلايا للحياة.
- يوفر رؤى بصرية إضافية حول مجموعات الخلايا.
- الطريقة متاحة للاستخدام في المختبرات البحثية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
The Tali Image-Based Cytometer bridges the gap between flow cytometry and fluorescence microscopy by delivering simultaneous quantitative and visual data for cell viability and GFP expression assays. This dual-output capability supports early discovery workflows where phenotypic confirmation and mechanistic de-risking require both population-level metrics and single-cell visualization. Its benchtop footprint, lower cost, and simplified operation enable decentralized use across discovery biology and assay development teams, reducing reliance on core facilities and accelerating go/no-go decisions in target validation pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating GFP expression with viability status in live-cell populations.
- Operational Value: Provides visual confirmation of transfection efficiency and protein localization alongside quantitative viability readouts.
- Predictive Value: Supports target confidence by distinguishing total GFP expression from expression in viable cells, reducing false-positive leads.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized histograms for cell size, PI fluorescence, and GFP intensity, enabling threshold-based gating for reproducible population analysis.
- Scalability: Processes thousands of cells per sample with consistent imaging and algorithmic analysis, supporting medium-throughput screening campaigns.
- Workflow Integration: Outputs are compatible with downstream analytics for hit selection and lead optimization in phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains assay consistency from discovery validation to preclinical models by providing comparable viability and expression data to flow cytometry.
- Mechanistic De-risking: Visual layering of brightfield, GFP, and PI signals confirms co-localization of transgene expression and cell death, clarifying mechanism of action.
- Predictive Confidence: Enables risk-adjusted advancement decisions by quantifying the fraction of live, transgene-expressing cells in heterogeneous populations.
Pipeline & Workflow Integration
The Tali cytometer fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification, where simultaneous viability and reporter gene assessment informs compound effects on cellular health and target engagement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking GFP reporter activity to cell survival, clarifying on-target versus off-target effects.
- Screening: Delivers quantitative fluorescence and viability outputs with visual validation, enhancing assay reproducibility and hit confirmation.
- Analytics: Provides histogram-based readouts for cell size, GFP intensity, and PI intensity, enabling statistical comparison across conditions and replicates.
- Translational Research: Ensures data continuity with preclinical workflows by mirroring flow cytometry outputs while adding visual context for mechanistic interpretation.
- Enterprise Reuse: Functions as a shared benchtop platform for multiple assays (viability, GFP/RFP expression, apoptosis), maximizing instrument utilization across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through correlated visual and quantitative data.
- Operational Value: Standardizes assay execution via disposable slides and automated image analysis, improving reproducibility and reducing user variability.
- Strategic Value: Accelerates discovery timelines by enabling rapid benchtop iteration without flow cytometry scheduling constraints.
- Portfolio Impact: Supports risk-based prioritization by quantifying live, transgene-positive cells, improving the quality of advancement candidates.
Implementation Considerations
- Requires basic training in fluorescence microscopy principles and threshold gating for fluorescence and scatter parameters.
- Depends on the Tali Image-Based Cytometer, Tali Cellular Analysis Slides, and Tali Viability Kit - Dead Cell Red reagent for PI-based viability detection.
- Necessitates standardization of staining protocols, incubation times, and focus procedures across users and sites for consistent results.
- Adaptation to other model systems may require optimization of cell concentration and staining conditions due to variations in size and autofluorescence.
- Practical limitations include inability to perform multi-parameter immunophenotyping beyond three channels and incompatibility with adherent cell assays without dissociation.
