الإنتاجية العالية لتخليق الكربوهيدرات وFunctionalization النانوية Polyanhydride
يوليو 6, 2012
في هذه المقالة، ويقدم وسيلة إنتاجية عالية لتركيب يغوساكاريدس وتمسكهم سطح النانوية polyanhydride لاستخدامها مرة أخرى في استهداف مستقبلات معينة على خلايا مقدمة للمستضد.
في مقالة الفيديو هذه ، نصف بروتوكول وضع مائي جديد لتخليق طور الحل الآلي للسكريات قليلة السكاريد وتشغيل الجسيمات النانوية poly anhy. باستخدام عوامل الاستهداف القائمة على الكربوهيدرات ، يتم تصنيع جزيئات الكربوهيدرات الأولى باستخدام نظام آلي يستخدم تخليق مرحلة المحلول بدلا من أجهزة توليف الطور الصلب. بعد ذلك ، يتم تنقية المواد الوسيطة قليلة السكاريد عن طريق بائع الزهور أو استخراج الطور الصلب أو FSPE.
تتميز جزيئات الكربوهيدرات المنتجة بالرنين المغناطيسي النووي ثم يتم ربطها بجسيمات النانو المتعددة أنهيدريد عن طريق اقتران الكربوهيدريد IDE. أخيرا ، تتميز الجسيمات النانوية الوظيفية للكربوهيدرات بالتحليل الطيفي للإلكترون الضوئي بالأشعة السينية ومقايسة حمض الكبريتيك فينيل المائية. في النهاية ، باستخدام منهجية وضع الماء الموضحة هنا ، تم الحصول على ظروف التفاعل لتحسين مورفولوجيا الجسيمات النانوية وكثافة الكربوهيدرات على سطح الجسيمات.
الميزة الرئيسية لهذه الطريقة على الطريقة الحالية مثل تخليق قليل السكاريد للوجه الصلب ، هي أننا في هذه الطريقة نستخدم كمية أقل بكثير من اللبنات الأساسية في هذه الطريقة ، عادة ما نستخدم اثنين إلى ثلاثة مكافئين بدلا من 10 إلى 20 ما يعادلها. لدينا أولا فكرة عن هذه الطريقة عندما نوضح فعالية التأثيرات السطحية ، وتشغيل الجسيمات النانوية المائية المتعددة ، باستخدام الكربوهيدرات لاستهداف مستقبلات CEEP على الخلايا المضادة للانبعاج. أردنا بعد ذلك تصميم نظام إنتاجية عالية يمكننا من فحص المعلمات المتعددة التي تشارك في تصنيع وتطبيق هذه الناقلات الجديدة.
يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن تطوير منصات آلية لتخليق السكريات قليلة السكاريد عالي الإنتاجية وارتباطها بجزيئات البوليمر هو مجال جديد للتحقيق دون توفر الكثير من الوثائق قبل التخليق الآلي لحمض الديانو. متبرع بالسكر محمي بشكل مناسب ، عادة ثلاثي كلورو أسيتاميد متقبل بشكل رئيسي في Alcon ، يتم تصنيع الكحول الفلوري على سطح الطاولة ويتم تحضيره في كلورو ميثان أيضا تحضير صومعة ثلاثي ميثيل ، ثلاثي فلورو ميثان سلفونات في كلورو الميثان ، 80٪ ميثانول و 100٪ ميثانول. تأكد من أن الرطوبة النسبية في الغرفة هي 30٪ أو أقل في غرفة الأتمتة.
الرطوبة العالية ضارة بتفاعلات الارتباط بالجليكوزيل. تتم الخطوات التالية باستخدام نظام أساسي للأتمتة. يتم إجراء الارتباط بالجليكوزيل الأول مع المتبرع وكحول بائع الزهور.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، يتم تنقية جزيء السكر الناتج عن بائع الزهور بواسطة FSPE. ثم تتم إزالة مجموعة الحماية المؤقتة بواسطة الصوديوم وأكسيد الميثامفيتامين والميثانول ، ومرة أخرى ، يتم تنقية المنتج بواسطة FSPE. بعد ذلك ، يتم استخدام سكر علامة بائع الزهور كمتقبل ويقترن بنفس المتبرع للحصول على السكريات الثنائية ، ويتم تنقية ثنائي السكاريد بواسطة FSPE للبدء.
ضع الكواشف ، بما في ذلك مروج المتقبل المتبرع ، 80٪ من ماء الميثانول ، 100٪ ميثانول ، أكسيد ميثامفيتامين الصوديوم في المنصة الروبوتية ، وابدأ البرنامج. ستقوم الذراع الروبوتية بسحب المتبرع ثم المتقبل من القوارير ونقلها إلى قارورة تفاعل. ثم يتم تقليب خليط المتبرع والمتقبل لمدة 30 دقيقة.
بعد مرور 30 دقيقة. ينقل الذراع الروبوتية صومعة ثلاثي الميثيل التحفيزي ، ثلاثي الفلورو ، سلفونات الميثان إلى الخليط. ثم يتم تقليب المحلول لمدة 30 دقيقة إضافية بعد اكتمال التقليب ، يتوقف البرنامج مؤقتا.
قم بإزالة كمية من 10 ميكرولتر للتحقق لمعرفة ما إذا كان التفاعل قد اكتمل بواسطة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة. إذا اكتمل التفاعل ، فلن يظهر جزيء المستقبل. إذا لم يكن التفاعل كاملا، فسيظل المستقبل الموجود على TLC مرئيا.
إذا كانت هذه هي الحالة ، فقم بإيقاف البرنامج ، وأعد ضبط توقيت الارتباط بالجليكوزيل حوالي 30 دقيقة ، وأضف فائضا من صومعة ثلاثي ميثيل المحفز ، ثلاثي الفلورو ، سلفونات الميثان. عند اكتمال التفاعل ، تابع الخطوة التالية. بمجرد اكتمال التفاعل ، ينقل الروبوت خليط التفاعل إلى خراطيش FSPE التي تحتوي على هلام السيليكا المعدل C nine F 17 للتنقية.
بعد ذلك ، يتم غسل الخراطيش بثمانية ملليلتر من 80٪ من الميثانول ، متبوعا بثمانية ملليلتر من الميثانول بنسبة 100٪. للتخلص من الكسر غير الفلوري ، يتم جمع التدفق في قارورة للحصول على المنتج المطلوب الموسوم ببائع الزهور. إذا كانت هناك حاجة إلى تنقية إضافية ، فقم بإيقاف الروبوت مؤقتا وإزالة منتجات التفاعل المناسبة.
اعتمادا على الهيكل ، يمكن أن يكون المتبرعون غير متفاعلين للغاية وسيتم ترك بعض جزيئات متقبل الزهور حتى بعد إضافة مروج كاف. إذا كانت هذه هي الحالة ، فلن يكون FSPE فعالا بما يكفي للتنقية ويمكن إجراء تنقية إضافية عبر كروماتوغرافيا عمود هلام السيليكا بعد التنقية ، تقوم الذراع الروبوتية بتوزيع أكسيد ميثامفيتامين الصوديوم في قارورة التفاعل. ثم يتم تقليب التفاعل لمدة ساعتين في المنصة الروبوتية ، إذا لم يكتمل على النحو الذي تحدده TLC ، فقم بتمديد فترة الحضانة لمدة ساعة تقريبا.
بعد الانتهاء من التفاعل ، يتم تنقية المنتج بواسطة FSPE كما كان من قبل. بعد ذلك ، قم بإزالة منتج التفاعل من الروبوت وعلى سطح الطاولة المعرض للذوبان في التولوين اللامائي ، متبوعا بالتبخر لإزالة الماء المتبقي. بمجرد أن تجف العينة ، ضعها مرة أخرى في الروبوت في نفس الدورة بما في ذلك تنقية الجليكوزيل بواسطة FSPE.
تتكرر الحماية العميقة لمجموعة الحماية المؤقتة متبوعة بالجليكوزيل حتى يتم الحصول على طول السلسلة المطلوب للجزيء المستهدف لحماية المنتج المحمي الذي تم الحصول عليه من الأتمتة ، وإزالة القارورة من الروبوت. تستخدم الخطوات النهائية للإجراء غاز الهيدروجين المتفجر ويجب إجراؤها خارج منصة الأتمتة. على أوقية الطاولة ، يحدث تحلل الرابطة المزدوجة في علامة بائع الزهور ويتبعه أكسدة الألدهيد المنتج إلى حمض الكربوكسيل.
قم بتنقية المنتج الناتج عن طريق كروماتوغرافيا عمود هلام السيليكا على سطح المقعد باستخدام خليط من 30٪ من الميثانول في ثنائي كلورو ميثان. أخيرا ، من أجل حماية مجموعات البنزو الأثير عن طريق الهدرجة المحفزة بالبلاديوم ، قم بتمرير المنتج عبر لوحة الأقمار الصناعية للتخلص من البلاديوم ، للحصول على المنتج النهائي النقي. توصيف المنتج بالكامل باستخدام الرنين المغناطيسي النووي أو التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي.
يتم إجراء تخليق البوليمر عالي الإسقاط وتصنيع الجسيمات النانوية وفقا للبروتوكول الذي وصفه بيترسون وآخرون. كما هو مشار إليه في الوثيقة المصاحبة ، يتكون جهاز الترسيب الآلي المستخدم لتشغيل الجسيمات من ثلاث مضخات ne 1000 ، مرحلة روبوتية متكاملة بواسطة محركين ، أحدهما للحركة في الاتجاه X والآخر للحركة في الاتجاه Y ومرحلة روبوتية ثانية مع رفين متجاورين يتكونان من ثلاثة مشغلات ، واحد لكل اتجاه يتم توصيل المضخات وما مجموعه خمسة مشغلات. يتم تشغيل المحركات والمضخات في سلسلة بواسطة جهاز كمبيوتر باستخدام برنامج عرض المختبر.
تعتمدأنظمة البوليمر المشترك المستخدمة في تصنيع الجسيمات على حمض SEBA أو SA وواحد ستة مكرر ، كربوكسي بارايك ، أوكسيل هيان أو CPH وواحد ثمانية BIS para carboxy phenoxy ثلاثة ستة ديوكسان أو CP Teeg. بعد مكان تصنيع الجسيمات النانوية ، يتم إجراء رف يحتوي على أنابيب الطرد المركزي سعة 1.7 مليلتر مع مكتبة جسيمات نانوية إلى مرحلة المشغل الخطي لربط الكربوهيدرات بسطح جزيئات بولي أنهي وتفاعل اقتران متوسط حمض الكربوكسيل يتكون من تفاعلين متتاليين للتفاعل الأول. املأ حقنة في مضخة حقنة قابلة للبرمجة بمحلول مائي من EDC وثنائي الإيثيلين بتركيز ملليغرامين لكل ملليغرام من الجسيمات النانوية و 0.6 ملليغرام لكل ملليغرام من الجسيمات النانوية على التوالي.
املأ حقنة ثانية في مضخة حقنة قابلة للبرمجة ب 2.5 ملليغرام لكل ملليغرام من جزيئات NHSA بإجمالي 12 مكافئا لكل عينة من الجسيمات النانوية ، وهو محلول مائي. بعد ذلك ، باستخدام برنامج عرض المختبر ، اطلب من الروبوت إيداع معلقات الكاشف في مكتبة الجسيمات النانوية. ستقوم مشغلات الروبوت بعد ذلك بنقل حامل الأنبوب إلى الموضع الصحيح في المنصة للاستغناء عن الحلول و EDC و NHS.
قم بتنشيط مجموعات حمض الكربوكسيل على سطح الجسيمات النانوية بولي أنهيدريد والسماح باقتران متوسط. بعد ذلك ، قم بغمر مسبار صوتنة في كل أنبوب وصوتنة كل عينة لمدة 30 ثانية عند 40 هرتز. قبل الانتقال إلى العينة التالية ، قم بتنظيف المسبار بالأسيتون.
بمجرد تشبع جميع العينات ، يتم فصل حامل الأنبوب عن المنصة الروبوتية. احتضان معلقات الجسيمات النانوية لمدة تسع ساعات مع دوران مستمر عند أربع درجات مئوية. يمكن تغيير أوقات رد الفعل للتفاعلات الأولى والثانية لضبط تركيز السكريات النهائي.
بعد اكتمال التفاعل ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 12 ، 000 مرة G لمدة خمس دقائق. في بيئة باردة ، عد إلى المحطة الروبوتية. أعد توصيل حامل الأنبوب بالذراع الآلي ، واملأ المحقنة الثانية في المنصة الروبوتية.
بالماء البارد ، يجب أن تظل المحقنة الأولى فارغة. ابدأ تشغيل الروبوت. يتم سحب المادة الطافية في كل أنبوب إلى المحقنة الفارغة وتقوم المضخة الثانية بإيداع الماء البارد في الأنابيب.
يتم تنفيذ هذه الخطوة لإزالة أي كواشف غير متفاعلة من تعليق الجسيمات النانوية. بعد ذلك ، قم بتجانس تعليق الجسيمات النانوية عن طريق الصوتنة كما هو موضح من قبل. ثم الطرد المركزي الأنابيب عند 12 ، 000 مرة G لمدة خمس دقائق.
قم بإجراء غسيل ثان بالماء البارد باستخدام الجهاز الآلي لحمل التفاعل الثاني 12 مكافئا لكل عينة من الجسيمات النانوية من EDC في المضخة الأولى و 12 مكافئا لكل عينة من الجسيمات النانوية من NHS في المضخة الثانية. ابدأ تشغيل المنصة الروبوتية لتوزيع كميات كافية في الأنابيب التي تحتوي على جسيمات نانوية. سيسمح وجود EDC و NHS بتكوين رابطة أميد بين مجموعات الأمين من ديت الإيثيلين المتصل بالفعل بسطح الجسيمات النانوية ومجموعة حمض الكربوكسيل للسكر المحمي بعمق.
بمجرد اكتمال الترسيب ، قم بتحميل 10 مكافئات من سكاريد معين. في هذه الحالة ، تم استخدام اللاكتوز والتحكم في حمض الجليكوليك في المضختين المتاحتين. يتم ترسيب كل سكاريد في أنابيب الاختبار اعتمادا على الوظيفة المطلوبة لتحقيقها في كل أنبوب ، والذي تمت برمجته مسبقا في برنامج عرض المختبر ، المستخدم لتشغيل المشغلات ووظائف المضخة للتفاعل المحدد المستخدم في هذه الدراسة لربط الكربوهيدرات ، يتم استخدام حمض الجليكوليك كعنصر تحكم في الرابط نظرا لأن السكريات المحمية بعمق لها بالفعل هذا الجزيء مرتبط تساهميا ، مما يسمح بمزيد من التعلق بسطح الجسيمات النانوية.
يتم تجانس معلقات الجسيمات النانوية عن طريق صوتنة كما كان من قبل ثم يتم احتضانها لمدة تسع ساعات مع دوران مستمر عند أربع درجات مئوية. بعد احتضان غسل معلقات الجسيمات النانوية عن طريق الطرد المركزي لإزالة المادة الطافية ، ثم يقوم Resus بتعليق الحبيبات في الماء البارد ووضع الأنابيب الصوتية ، والتي تحتوي الآن على مكتبة الجسيمات النانوية الوظيفية في غرفة مفرغة لتجف لمدة ساعتين على الأقل. تتميز الجسيمات النانوية الوظيفية بتشتت الضوء الديناميكي وطرق أخرى لتقييم تكوين السطح وتركيزه وحجم الجسيمات وتوزيع الحجم وشحنة السطح.
تم تصنيع جانب الديانو المحمي بالكامل الموضح هنا باستخدام منصة الأتمتة. تميز المركب المركب بالرنين المغناطيسي النووي للبروتون في مطياف VXR 400 ميجاهرتز. باستخدام CDC 13 كمذيب ، يمكن تأكيد تكوين المنتج من وجود بعض القمم المميزة.
في مخطط الرنين المغناطيسي النووي للبروتون، البروتونات الأربعة من 1.79 إلى 2.21 وبروتونين عند 3.38 من علامة بائع الزهور. تتوافق الذروة المفردة عند 2.16 مع ذروة الأسيتات عند 4.94 و 5.11 هي البروتونات الشاذة لتقييم تأثير وقت التفاعل على التشكل النهائي للجسيمات النانوية ودرجة ارتباط السكر التي تم تحقيقها. تم تشغيل الجسيمات النانوية مع زيادة أوقات التفاعل كما هو موضح هنا ، زاد تركيز الديانو على سطح الجسيمات النانوية 50 50 CPT CPH مع إجمالي وقت التفاعل ووصل إلى الحد الأقصى بعد 18 ساعة.
ثم تم استخدام الجسيمات النانوية التي تعمل بوقت تفاعل إجمالي مدته 24 ساعة لتقييم قدرتها على استهداف CLRs على الخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع عظم الفأر باستخدام قياس التدفق الخلوي كما هو موضح هنا. لوحظ زيادة التعبير عن علامة DC ومستقبلات مانو لمستقبلات الليكتين من النوع C بعد التحفيز مع الجسيمات النانوية غير الوظيفية وكذلك اللاكتوز والدانو الوظيفية. يشير هذا إلى الاستهداف الفعال.
ومع ذلك ، أظهرت جسيمات ديانو الوظيفية مستوى أعلى من التعبير مما يشير إلى خصوصية هذا الترابط للمستقبلات التي تمت دراستها. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء التوليف الآلي عالي الإنتاجية للسكريات قليلة السكاريد بالإضافة إلى تشغيل الجسيمات النانوية المتعددة. باستخدام قاعدة الكربوهيدرات هذه في استهداف الوكلاء ، بمجرد إتقان تخليق السكر المحمي المتبرع ، وكذلك يمكن تجميع الجهاز في غضون 24 إلى 48 ساعة.
بالطبع ، يعتمد الطول الزمني على حجم المكتبة بالإضافة إلى وقت الوظيفية. أثناء حضور هذه الطريقة ، من المهم أن تتذكر أنه يمكنك تحسين ظروف تفاعل وظيفية الجسيمات المائية البولية القابلة للتحلل اعتمادا على كيمياء الجسيمات النانوية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تصنيع هياكل مختلفة من الكربوهيدرات من أجل استهداف مستقبلات الخلايا المختلفة للتأثير على النتيجة المناعية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا جديدًا لوضع الهيدرو لتركيب السكريات الأولية ووظيفتها على جسيمات نانوية متعددة الأنهيدريد. تعزز الطريقة قدرات الاستهداف لمستقبلات محددة على الخلايا المقدمة للمستضدات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الكيمياء الحيوية
- تقنية النانو
الخلفية
- تلعب السكريات الأولية دورًا حاسمًا في التفاعلات الخلوية.
- تعد جسيمات نانوية متعددة الأنهيدريد واعدة لتوصيل الأدوية.
- يمكن أن تحسن طرق التركيب الآلي الكفاءة.
- تقنيات التوصيف ضرورية للتحقق من صحة التصنيع.
غرض الدراسة
- لتطوير طريقة عالية الإنتاجية لتركيب السكريات الأولية.
- لوظيفنة الجسيمات النانوية للتوصيل الموجه.
- لتحسين ظروف التفاعل لmorfology الجسيمات النانوية.
الطرق المستخدمة
- تركيب الطور المحلول الآلي للسكريات الأولية.
- التنقية باستخدام استخراج الطور الصلب فلوريستر (FSPE).
- التوصيف بواسطة طيفي NMR.
- ربط السكريات الأولية بالجسيمات النانوية عبر الترابط carbo IDE.
النتائج الرئيسية
- تركيب ونقاء ناجحين لجزيئات الكربوهيدرات.
- أكد التوصيف للجسيمات النانوية الوظيفية الربط الناجح.
- ظروف محسنة لكثافة الكربوهيدرات على أسطح الجسيمات النانوية.
الخلاصات
- طريقة وضع الهيدرو فعالة لتركيب السكريات الأولية.
- تعزز الجسيمات النانوية الوظيفية من استهداف الخلايا المقدمة للمستضدات.
- قد يطور هذا النهج أنظمة توصيل الأدوية في علم الأعصاب.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput synthesis of carbohydrate-based targeting ligands and their attachment to polyanhydride nanoparticles, supporting the rational design of vaccine carriers with enhanced immunogenicity. By reducing building block requirements and automating synthesis and functionalization, it accelerates screening of multi-parametric systems for immunomodulatory effects. The approach addresses the scarcity of structurally defined carbohydrates, facilitating reproducible production of ligand-decorated nanoparticles for immune cell targeting studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of carbohydrate-receptor interactions, such as mannose-based ligands with C-type lectin receptors on dendritic cells.
- Operational Value: Automated solution-phase synthesis uses 2-3 equivalents of building blocks versus 10-20 in solid-phase methods, conserving scarce resources.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by allowing systematic variation of sugar density and reaction time to correlate with receptor engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces purified oligosaccharide intermediates characterized by NMR, ensuring defined chemical structures for reproducible bioactivity.
- Operational Value: Integrates fluorous solid-phase extraction (FSPE) for intermediate purification, enabling automation-compatible workflows with minimal manual intervention.
- Scalability: Robotic platform operated by LabVIEW allows deposition of reagents into nanoparticle libraries for parallel functionalization screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Carbohydrate-functionalized nanoparticles demonstrate increased expression of DC-SIGN and mannose receptor on mouse bone marrow-derived dendritic cells, indicating receptor-specific targeting.
- Preclinical Continuity: Enables optimization of nanoparticle morphology and ligand density, critical parameters for in vivo immunogenicity and antigen presentation.
- Risk Mitigation: Functionalization via carbodiimide conjugation allows controlled attachment of ligands, reducing batch variability in vaccine carrier prototypes.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early carbohydrate synthesis with nanoparticle functionalization, supporting progression from target validation to preclinical evaluation of immunomodulatory delivery systems.
- Discovery Biology: Automated oligosaccharide synthesis supports hypothesis testing of carbohydrate-mediated immune modulation through precise ligand generation.
- Screening: FSPE purification and robotic deposition enable standardized, quantitative production of functionalized nanoparticle libraries for receptor binding assays.
- Analytics: NMR and XPS characterization provide structural and surface composition data to correlate ligand presentation with biological activity.
- Translational Research: Optimization of reaction time (e.g., 18 hours for maximal sugar attachment) informs dose-response relationships for cellular uptake and receptor engagement.
- Enterprise Reuse: Automated platform can be repurposed for diverse oligosaccharide targets and nanoparticle chemistries, supporting sustained use across discovery campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in structure-activity relationships through defined carbohydrate ligands and controlled surface density on nanoparticles.
- Operational Value: Standardization via automated synthesis and purification reduces lot-to-lot variability in vaccine carrier prototypes.
- Strategic Value: Enables rapid screening of multi-parametric systems (ligand type, density, reaction conditions) to prioritize candidates with optimal immunomodulatory profiles.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted advancement decisions supported by reproducible generation of targeting ligands that enhance antigen-presenting cell activation.
Implementation Considerations
- Expertise in carbohydrate chemistry, automation programming (LabVIEW), and nanoparticle surface chemistry is required.
- Instrumentation includes robotic synthesis platform, FSPE cartridges, NMR spectrometer, and XPS or DLS for nanoparticle characterization.
- Cross-team standardization necessitates shared protocols for glycosylation timing, purification thresholds, and functionalization conditions.
- Adaptation across model systems requires validation of ligand stability and receptor binding in relevant immune cell types.
- Practical limitations include sensitivity to humidity (<30% RH) during glycosylation and potential need for orthogonal purification if FSPE is inefficient for certain donors.
