الإنتاجية العالية لتخليق الكربوهيدرات وFunctionalization النانوية Polyanhydride

نصف في هذا المقال المرئي بروتوكولاً مائياً جديداً للتخليق الآلي في الطور السائل للسكريات قليلة التعدد ووظائف الجسيمات النانوية البوليمرية اللامائية. وباستخدام عوامل الاستهداف القائمة على الكربوهيدرات هذه، يتم أولاً تخليق جزيئات الكربوهيدرات باستخدام نظام آلي يعتمد التخليق في الطور السائل بدلاً من أجهزة التخليق في الطور الصلب. بعد ذلك، يتم تنقية وسائط السكريات قليلة التعدد بواسطة استخلاص الطور الصلب السريع (FSPE).

يتم توصيف جزيئات الكربوهيدرات الناتجة بواسطة الرنين المغناطيسي النووي (NMR)، ثم تُربط بجسيمات البولي أنهيدريد النانوية عن طريق اقتران الكربويد (carbo IDE). وفي الختام، يتم توصيف الجسيمات النانوية الوظيفية المطعمة بالكربوهيدرات باستخدام مطيافية الأشعة السينية للإلكترونات الضوئية ومقايسة حمض الهيدروكسي-فينيل كبريتيك. وأخيراً، وباستخدام منهجية الهيدرو بوت (hydro put) الموصوفة هنا، تم الحصول على ظروف التفاعل اللازمة لتحسين مورفولوجيا الجسيمات النانوية وكثافة الكربوهيدرات على سطح الجسيم.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة مقارنة بالطرق الحالية، مثل تخليق السكريات المتعددة على سطح صلب، في استخدامنا لكمية أقل بكثير من وحدات البناء؛ حيث نستخدم في هذه الطريقة عادةً ما يتراوح بين مكافئين إلى ثلاثة مكافئات بدلاً من 10 إلى 20 مكافئاً. لقد تبلورت فكرة هذه الطريقة لدينا عندما أثبتنا فعالية تأثيرات السطح، ووظيفة الجسيمات النانوية من البولي هيدرو، باستخدام الكربوهيدرات لاستهداف مستقبلات ceep على خلايا anti denting. ومن ثم، أردنا تصميم نظام عالي الإنتاجية يتيح لنا فحص المعايير المتعددة الداخلة في تصنيع وتطبيق هذه الناقلات المبتكرة.

يُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن تطوير منصات مؤتمتة للتخليق عالي الإنتاجية للسكريات قليلة التعدد وربطها بجسيمات بوليمرية يمثل مجال بحث حديث يفتقر إلى الكثير من التوثيق المتاح. قبل البدء بالتخليق المؤتمت لحمض الديانو، يتم تخليق مانح سكري محمي بشكل مناسب، وعادة ما يكون tri chloro acetamide، ومستقبل بشكل أساسي في Alcon، وكحول فلوري على سطح المختبر وتحضيرهما في chloro methane، كما يتم تحضير trimethyl silo و tri fluoro methane sulfonate في chloro methane، و 80%methanol و 100%methanol. تأكد من أن الرطوبة النسبية في الغرفة 30% أو أقل داخل غرفة الأتمتة.

تعد الرطوبة العالية ضارة بتفاعلات الغلكزة. تُنفذ الخطوات التالية باستخدام منصة أتمتة. تُجرى عملية الغلكزة الأولى باستخدام المانح وكحول الفلورست.

بمجرد الانتهاء، يتم تنقية جزيء السكر الناتج الذي يحمل علامة florist بواسطة FSPE. بعد ذلك، يتم إزالة مجموعة الحماية المؤقتة باستخدام صوديوم ميثوكسيد والميثانول، ويتم تنقية المنتج مرة أخرى بواسطة FSPE. بعد ذلك، يُستخدم سكر علامة florist كمستقبل ويُربط بنفس المانح للحصول على السكر الثنائي، ثم يُنقى السكر الثنائي بواسطة FSPE لبدء العملية.

ضع الكواشف، بما في ذلك المروج المانح والمستقبل، ومحلول ميثانول بنسبة 80% في الماء، وميثانول بنسبة 100%، وميثوكسيد الصوديوم في المنصة الروبوتية، ثم ابدأ البرنامج. سيقوم الذراع الروبوتية بسحب المانح ثم المستقبل من القوارير ونقلهما إلى قارورة التفاعل. بعد ذلك، يتم تحريك خليط المانح والمستقبل لمدة 30 دقيقة.

بعد مرور 30 دقيقة، يقوم الذراع الروبوتي بنقل catalytic trimethyl silo, tri fluoro, methane sulfonate إلى الخليط. ثم يتم تحريك المحلول لمدة 30 دقيقة إضافية. وبعد اكتمال عملية التحريك، يتوقف البرنامج مؤقتاً.

قم بإزالة جزء قدره 10 µL للتحقق مما إذا كان التفاعل قد اكتمل بواسطة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة. إذا اكتمل التفاعل، فلن تظهر جزيئة المستقبل. أما إذا لم يكتمل التفاعل، فسيظل المستقبل مرئياً في تحليل TLC.

إذا كان الأمر كذلك، أوقف البرنامج، وأعد ضبط توقيت عملية الغلكزة (glycosylation) إلى حوالي 30 دقيقة، ثم أضف كمية زائدة من المحفز trimethyl silyltrifluoromethanesulfonate. وعندما يكتمل التفاعل، انتقل إلى الخطوة التالية. وبمجرد اكتمال التفاعل، يقوم الروبوت بنقل خليط التفاعل إلى خراطيش FSPE التي تحتوي على هلام السيليكا المعدل بـ C9 F17 لغرض التنقية.

بعد ذلك، تُغسل الخراطيش بـ 8 mL من ميثانول 80%، يليه 8 mL من ميثانول 100%. ولإزالة الجزء غير المرتبط بـ floris، يتم جمع السائل المتدفق في أنبوب اختبار للحصول على منتج floris المسمى المطلوب. وإذا كانت هناك حاجة إلى تنقية إضافية، يتم إيقاف الروبوت مؤقتاً وإزالة نواتج التفاعل المناسبة.

اعتماداً على البنية، يمكن أن تكون المانحات غير تفاعلية للغاية، وقد تتبقى بعض الجزيئات المتقبلة المفلورة حتى بعد إضافة كمية كافية من المحفز. وفي هذه الحالة، لن يكون استخلاص الطور الصلب السريع (FSPE) فعالاً بما يكفي للتنقية، وقد يتم إجراء تنقية إضافية عبر كروماتوغرافيا العمود بهلام السيليكا بعد التنقية؛ حيث يقوم الذراع الروبوتي بتوزيع ميثوكسيد الصوديوم في وعاء التفاعل. ثم يتم تحريك التفاعل لمدة ساعتين في المنصة الروبوتية، وإذا لم يكتمل التفاعل وفقاً لما تحدده كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC)، يتم تمديد فترة التحضين لمدة ساعة تقريباً.

بعد اكتمال التفاعل، يتم تنقية الناتج بواسطة FSPE كما سبق. بعد ذلك، يتم إخراج ناتج التفاعل من الروبوت وإذابته على طاولة المختبر في التولوين اللامائي (anhydrous toluene)، متبوعاً بالتبخير لإزالة الماء المتبقي. وبمجرد جفاف العينة، تُعاد إلى الروبوت في نفس الدورة بما في ذلك تنقية الجليكوزيلة (glycosylation) بواسطة FSPE.

تُكرر عملية الحماية العميقة لمجموعة الحماية المؤقتة متبوعة بعملية الغليكوزيلة حتى يتم الحصول على طول السلسلة المطلوب للجزيء المستهدف؛ ولإزالة حماية المنتج المحمي الذي تم الحصول عليه من خلال التشغيل الآلي، يتم إزالة القارورة من الروبوت. تستخدم الخطوات النهائية من الإجراء غاز الهيدروجين المتفجر ويجب تنفيذها خارج منصة التشغيل الآلي. وعلى طاولة المختبر، يحدث تحلل الرابطة المزدوجة في علامة الفلوريست، ويتبع ذلك أكسدة الألدهيد الناتج إلى حمض كربوكسيلي.

قم بتنقية المنتج الناتج عن طريق كروماتوغرافيا العمود باستخدام هلام السيليكا على طاولة المختبر، باستعمال خليط مكون من 30% methanol في di chloro methane. وأخيراً، لإزالة حماية مجموعات benzo ether عن طريق الهدرجة المحفزة بالبالاديوم، مرر المنتج عبر وسادة تصفية (satellite pad) للتخلص من البالاديوم، وذلك للحصول على المنتج النهائي النقي. قم بتوصيف المنتج بشكل كامل باستخدام مطيافية الرنين المغناطيسي النووي أو NMR spectroscopy.

يتم إجراء تخليق البوليمرات وتصنيع الجسيمات النانوية ذات الإنتاجية العالية وفقاً للبروتوكول الذي وصفه Peterson et al. وكما هو موضح في المستند المرفق، يتكون جهاز الترسيب الآلي المستخدم لوظائف الجسيمات من ثلاث مضخات ne 1000، ومنصة روبوتية مدمجة بمشغلين، أحدهما للحركة في اتجاه X والآخر للحركة في اتجاه Y، ومنصة روبوتية ثانية تحتوي على رفوف متجاورة تتكون من ثلاثة مشغلات، مشغل واحد لكل اتجاه. يتم توصيل المضخات وخمسة مشغلات إجمالاً على التوالي، ويتم تشغيل المشغلات والمضخات بواسطة جهاز كمبيوتر باستخدام برنامج lab view.

تعتمد أنظمة البوليمرات المشتركة المستخدمة في تصنيع الجسيمات على حمض SEBA أو SA، وواحد سداسي بيس، بارايك كاربوكسي، أوكسيل هين أو CPH، وواحد ثماني بيس بارا كاربوكسي فينوكسي ثلاثة سداسي ديوكسان أو CP Teeg. بعد عملية تصنيع الجسيمات النانوية، يوضع حامل يحتوي على أنابيب طرد مركزي سعة 1.7 milliliter مع مكتبة الجسيمات النانوية على مرحلة المشغل الخطي لربط الكربوهيدرات بسطح جسيمات البولي أنهايدريد، ويتم إجراء تفاعل ربط حمض الكربوكسيل المتوسط المكون من تفاعلين متتاليين؛ بالنسبة للتفاعل الأول، يتم ملء محقنة في مضخة محقنة قابلة للبرمجة بمحلول مائي من EDC وإيثيلين ديامين بتركيز 2 mg/mg من الجسيمات النانوية و 0.6 mg/mg من الجسيمات النانوية على التوالي.

املأ محقنة ثانية في مضخة محاقن قابلة للبرمجة بـ 2.5 milligrams per milligram من جسيمات NHSA، بمجموع 12 equivalents لكل عينة جسيمات نانوية، في محلول مائي. بعد ذلك، وباستخدام برنامج lab view، وجّه الروبوت لإيداع معلقات الكواشف في مكتبة الجسيمات النانوية. ستقوم مشغلات الروبوت بعد ذلك بتحريك حامل الأنابيب إلى الموضع الصحيح في المنصة لصرف المحاليل، و EDC و NHS.

قم بتنشيط مجموعات حمض الكربوكسيل الموجودة على سطح جسيمات بولي أنهيدريد النانوية للسماح بعملية الربط المتوسط. بعد ذلك، اغمر مسبار السونيكاتور في كل أنبوب وقم بمعالجة كل عينة بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 ثانية بتردد 40 hertz. وقبل الانتقال إلى العينة التالية، نظف المسبار باستخدام الأسيتون.

بمجرد تشبع جميع العينات، يتم فصل حامل الأنابيب عن المنصة الروبوتية. تُحضن معلقات الجسيمات النانوية لمدة تسع ساعات مع تدوير مستمر عند درجة حرارة 4 °C. يمكن تغيير أوقات التفاعل للتفاعلين الأول والثاني لضبط التركيز النهائي للسكاريد.

بعد اكتمال التفاعل، قم بطرد الأنابيب مركزياً عند 12,000 ×g لمدة خمس دقائق. وفي بيئة باردة، عُد إلى المحطة الروبوتية. أعد تثبيت حامل الأنابيب في الذراع الروبوتية، واملأ الحقنة الثانية في المنصة الروبوتية.

عند استخدام الماء البارد، يجب أن تظل السرنجة الأولى فارغة. ابدأ بتشغيل الروبوت. يتم سحب الطافي في كل أنبوب إلى السرنجة الفارغة، بينما تقوم المضخة الثانية بوضع الماء البارد في الأنابيب.

تُجرى هذه الخطوة لإزالة أي كواشف غير متفاعلة من معلقات الجسيمات النانوية. بعد ذلك، يتم تجنيس معلق الجسيمات النانوية عن طريق المعالجة بالموجات فوق الصوتية كما تم توضيحه سابقاً. ثم تُطرد الأنابيب مركزياً عند 12,000 ×g لمدة خمس دقائق.

قم بإجراء غسلة ثانية بالماء البارد باستخدام الجهاز الروبوتي للشحنة التفاعلية الثانية، وضع 12 مكافئاً لكل عينة جسيم نانوي من EDC في المضخة الأولى و12 مكافئاً لكل عينة جسيم نانوي من NHS في المضخة الثانية. ابدأ تشغيل المنصة الروبوتية لتوزيع أحجام مناسبة في الأنابيب التي تحتوي على الجسيمات النانوية. سيتيح وجود EDC و NHS تكوين رابطة أميدية بين مجموعات الأمين من ethylene dite المرتبط بالفعل بسطح الجسيم النانوي ومجموعة حمض الكربوكسيليك للسكر المحمي بعمق.

بمجرد اكتمال عملية الترسيب، يتم تحميل 10 مكافئات من سكر محدد. في هذه الحالة، تم استخدام اللاكتوز وحمض الجليكوليك كعينة ضابطة في المضختين المتاحتين. يتم ترسيب كل سكر في أنابيب اختبار بناءً على الوظيفية المراد تحقيقها في كل أنبوب، والتي تم برمجتها مسبقاً في برنامج LabVIEW المستخدم لتشغيل المشغلات ووظائف المضخات للتفاعل المحدد المطبق. وفي هذه الدراسة الخاصة بربط الكربوهيدرات، يُستخدم حمض الجليكوليك كعينة ضابطة للرابط، نظراً لأن السكريات محمية بعمق تحتوي بالفعل على هذا الجزيء مرتبطاً تساهمياً، مما يسمح بمزيد من الارتباط بسطح الجسيم النانوي.

يتم تجانس معلقات الجسيمات النانوية عن طريق المعالجة بالموجات فوق الصوتية كما سبق، ثم تُحضن لمدة تسع ساعات مع تدوير مستمر عند درجة حرارة 4 °C. بعد التحضين، تُغسل معلقات الجسيمات النانوية عن طريق الطرد المركزي لإزالة السائل الطافي، ثم يُعاد تعليق الراسب في ماء بارد ومعالجته بالموجات فوق الصوتية. توضع الأنابيب، التي تحتوي الآن على مكتبة الجسيمات النانوية الوظيفية، في غرفة مفرغة من الهواء لتجف لمدة ساعتين على الأقل. يتم توصيف الجسيمات النانوية الوظيفية بواسطة تشتت الضوء الديناميكي وطرق أخرى لتقييم تركيب السطح، والتركيز، وحجم الجسيمات، وتوزيع الحجم، وشحنة السطح.

تم تخليق جانب الديانو المحمي بالكامل الموضح هنا باستخدام منصة الأتمتة. وتم توصيف المركب المُخلق عن طريق الرنين المغناطيسي النووي للبروتون (proton NMR) في مطياف VXR 400 megahertz. وباستخدام CDC 13 كمذيب، يمكن تأكيد تكوين المنتج من خلال وجود بعض القمم المميزة.

في مخطط الرنين المغناطيسي النووي للبروتون (proton NMR)، تظهر البروتونات الأربعة من 1.79 إلى 2.21 والبروتونان عند 3.38 كجزء من علامة florist. وتتوافق ذروة السينجلت (singlet peak) عند 2.16 مع ذروة الأسيتات، بينما تمثل الذروتان عند 4.94 و 5.11 البروتونات الأنوميرية لتقييم تأثير زمن التفاعل على المورفولوجيا النهائية للجسيمات النانوية ودرجة ارتباط السكر المحققة. تم وظيفي الجسيمات النانوية مع زيادة أزمنة التفاعل كما هو موضح هنا، حيث زاد تركيز diano على سطح جسيمات 50 50 CPT CPH النانوية مع إجمالي وقت التفاعل ووصل إلى الحد الأقصى بعد 18 ساعة.

استُخدمت الجسيمات النانوية التي تم وظيفياً لمدة تفاعل إجمالية بلغت 24 hour لتقييم قدرتها على استهداف مستقبلات الليكتين من النوع C (CLRs) في الخلايا الشجرية المشتقة من نخاع العظم للفئران باستخدام قياس التدفق الخلوي كما هو موضح هنا. وقد لوحظ زيادة في تعبير DC sign ومستقبل mano بالنسبة لمستقبلات الليكتين من النوع C بعد التحفيز بالجسيمات النانوية غير الوظيفية، وكذلك الجسيمات النانوية الوظيفية باللاكتوز والدانو. ويشير هذا إلى استهداف فعال.

ومع ذلك، أظهرت الجسيمات الموظيفية بـ Diano مستوى أعلى من التعبير، مما يشير إلى خصوصية هذا الربيطة للمستقبلات التي تمت دراستها. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية إجراء التصنيع الآلي عالي الإنتاجية للسكريات قليلة التعدد، بالإضافة إلى توظيف الجسيمات النانوية البوليمرية. وباستخدام هذه الكربوهيدرات كعوامل استهداف، وبمجرد إتقان تصنيع السكر المحمي بالمانح والمستقبل، يمكن إتمام تجميع الجهاز في غضون 24 إلى 48 ساعة.

بالطبع، تعتمد المدة الزمنية على حجم المكتبة وكذلك وقت الوظيفية. وأثناء تطبيق هذه الطريقة، من المهم تذكر أنه يمكنك تحسين ظروف تفاعل وظيفية الجسيمات المائية المتعددة القابلة للتحلل الحيوي بناءً على كيمياء الجسيمات النانوية. ومن خلال اتباع هذا الإجراء، يمكن تخليق هياكل مختلفة من الكربوهيدرات من أجل استهداف مستقبلات خلوية مختلفة للتأثير على النتيجة المناعية.