ارتفاع الإنتاجية وحيدة الخلية ومتعددة الخلية الصغيرة التغليف

غالبا ما تكون التطبيقات التي تستخدم الخلايا المغلفة في قطرات صغيرة بحجم البيكوليتر محدودة بسبب عدم القدرة على التحكم في عدد الخلايا لكل قطرة. يوضح هذا البروتوكول طريقة للتحكم في تغليف الخلية من خلال الجمع بين ظاهرتين متميزتين للموائع الدقيقة ، وترتيب الخلايا الديناميكية للسوائل وتوليد السقوط في فوهة دقيقة تركز على التدفق. في قناة المنبع ، يتم توفير معدل تدفق مرتفع بما فيه الكفاية للمحلول المائي مع الخلايا أو الجسيمات العالقة للتسبب في تكوين قطارات بتباعد متساو في اتجاه التدفق في اتجاه مجرى النهر.

تستخدم فوهة توليد قطرة تركيز التدفق لتكوين قطرات مائية بمعدلات كيلو هرتز في سائل ناقل زيت مقبول مستقر للتوتر السطحي. ثم يتم دمج قطارات جسيمات الخلية المرتبة مع توليد القطرات عن طريق ضبط معدلات التدفق المائي والزيت لتوفير معدلات توليد القطرات المتزامنة مع وصول الخلايا أو الجسيمات المرتبة طوليا إلى فوهة توليد القطرات ، بينما يتم استخدام الجسيمات كبدائل للخلايا. لإثبات هذا البروتوكول ، يجب أن تكون معدلات التدفق صغيرة بما يكفي للحد من السوائل.

يشدد الشديد على الخلايا البيولوجية ، وتداخل الخلية التي تأمر بتوليد القطرات وقابلية الخلية للحياة. توفر قيود معدل التدفق المائي نظاما تشغيليا مثاليا للتغليف الخاضع للرقابة للخلايا المفردة والمتعددة. يظهر تحليل بيانات الفحص المجهري بالفيديو أن كفاءات تغليف الجسيمات أو الخلية المفردة والمزدوجة تتفوق على كفاءات التغليف العشوائية وتقلل بشكل كبير من عدد القطرات التي لا تحتوي على العدد المطلوب من الخلايا أو الجسيمات.

يحد حبس الخلايا والقطرات من تخفيف إفرازات الخلايا ، ويسلط الضوء على عدم تجانس الخلايا ويتحكم أيضا في الإشارات بين الخلايا عند مقارنته بالتعليق السائب. توفر الوسائل الفعالة لتغليف هذه الخلايا في قطرات أداة قيمة للباحثين البيولوجيين لبدء هذا الإجراء. صمم نمط قناة صغيرة كما هو موضح في هذا الشكل في برنامج AutoCAD.

يمثل قسم القناة الطويلة قناة ترتيب التدفق المائي بعرض 27 ميكرون. يظهر تخطيط الفوهة الموسع عرضا متساويا للقناة يبلغ 27 ميكرون لقناة الطلب المائية وقناة الزيت ، متبوعا بانكماش الفوهة بمقدار 22 ميكرون وتمدد مفاجئ إلى قناة أوسع 61 ميكرون. ارتفاع الجهاز 52 ميكرون.

تحتوي كل من المداخل المائية والنفط على مرشحات حطام كبيرة بها فجوات في ترتيب عرض قناة الطلب كما يتضح من هذا التخطيطي الموسع لمدخل النفط. تفعيلك. فيما يلي صورة حقيقية لقناة الطلب والفوهة المحقونة بالصبغة. استخدم شركة مصنعة تابعة لجهة خارجية لطباعة قناع شفاف عالي الدقة على فيلم مايلر أو الكوارتز حيث تكون القنوات شفافة على خلفية داكنة.

بعد ذلك ، قم بإنشاء سيد مقاوم للضوء من السيليكون و SU ثمانية لتشكيل النسخة المتماثلة. قم بلصق القالب الرئيسي في الجزء السفلي من طبق بتري لقولبة النسخة المتماثلة PDMS. بعد اكتمال التشكيل المتماثل وقطع مخطط الجهاز ، استخدم لكمة خزعة بقطر خارجي 0.75 ملم لكمة منافذ السوائل في المناطق الدائرية الثلاث الموضحة في هذا الشكل ، شريط سكوتش عزيز على جانب النمط من PDMS وتقشيره لإزالة أي غبار بعد ربط البلازما.

PDMS إلى شريحة مجهر زجاجي نظيف. ضع الجهاز بالكامل في الفرن وقم بتسخين الفرن تدريجيا حتى 120 درجة مئوية. اترك الجهاز في فرن 120 درجة مئوية طوال الليل لإكمال الترابط وإعادة PDMS إلى حالته الأصلية الكارهة للماء.

طريقة بديلة لجعل السطح الزجاجي للقناة كارها للماء هي حقن طلاء مثل aquae في المنافذ السائلة ثم تطهيرها بالهواء. باستخدام حقنة سعة مليلتر واحد وإبرة حقنة ، قم بسحب عدة مئات من الميكرولترات من الهواء ، متبوعا بكمية صغيرة من الأكويل بما يكفي لملء طرف المحقنة المعدنية فقط بعناية ، ولكن قم بحقن الماء بقوة متبوعا بالهواء المطهر في المنافذ السائلة. دون كسر PDMS للرابطة الزجاجية بقوة.

كرر تطهير الهواء على جميع منافذ المدخل والتوقعات أثناء مسح أي مائية زائدة لتجنب أي رواسب قد تسد القنوات عند التجفيف. يعد التحكم في تركيز الخلية أمرا ضروريا لتحقيق العدد المناسب من الخلايا إلى العدد المناسب من القطرات. هذا له مكونان صعبان.

الأول هو تقدير التركيز المناسب مسبقا ، والثاني هو الحفاظ على هذا التركيز أثناء التجربة بالنسبة للجهاز المعين المستخدم في هذه الدراسة ، يجب أن تطلب ثماني إلى 15 ميكرون خلايا أو جسيمات بشكل كاف للتغليف الخاضع للرقابة. في هذا العرض التوضيحي ، سيتم استخدام الكريات المجهرية اليوميات 9.9 ميكرون كبدائل للخلية لإعداد تركيز تعليق الجسيمات المائية لتحقيق تغليف التدقيق المثالي ، بدءا بتركيز مخزون الكرة المجهرية بنسبة 1٪ من المواد الصلبة بالوزن باستخدام البيانات السابقة للطلب الكامل. كدليل ، قم بزيادة التركيز إلى 1.5٪ من المواد الصلبة عن طريق التنقية برفق ملليلتر واحد من عينة المخزون ، وإزالة 250 ميكرولتر من السائل السوبينات و Resus لتعليق الجسيمات عن طريق الخلط الدوامي أو الخلط اللطيف.

عند استخدام الخلايا ، يكون لكل من الخلايا وجزيئات البوليسترين ثقل نوعي أكبر من واحد ، على الرغم من عدم عرضه في هذا الفيديو. بالنسبة للتجارب طويلة المدى التي تستمر من عدة دقائق إلى ساعات ، قد يكون المحلول متطابقا مع الطفو عن طريق إضافة مذاب مثل كلوريد الكالسيوم للجزيئات أو التحضير الأمثل للخلايا. بعد أن يصبح تعليق الخلية أو الجسيمات جاهزا ، قم بإعداد عينة سعة 10 مليلتر من مرحلة زيت الفلوروكربون المستمر في دوامة أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل.

امزج الفاعل بالسطح وزيت الفلوروكربون بوزن 2.5٪ تقريبا. هنا نحصل على خليط وزن 2.4 ، وهو أمر مقبول لإعداد تجربة التغليف الدقيق. أولا ، قم بتشغيل طاقة المجهر البصري المقلوب والكاميرا عالية السرعة.

ركز على طبقة القناة الدقيقة وافحص القنوات بحثا عن السدادات وأي حطام يمكن أن ينزح. حدد قناة خالية من الحطام الكبير أو السدادات الواضحة. قم بقص ثلاثة أطوال من أنابيب tigon PVC الشفافة لمدخل زيت المدخل المائي ومخرج المستحلب لتقليل الحجم الميت.

قطع ما يكفي من الأنابيب للوصول من مضخات الحقنة إلى المجهر. ينتهي الأنابيب المقطوعة بزاوية 45 درجة لتسهيل الإدخال في المنافذ السائلة ، استخدم الملقط للضغط على نهايات الأنبوب في المنافذ السائلة. ثم اضغط على إبرة حقنة من الفولاذ المقاوم للصدأ ذات طرف حاد قياس 30 في الطرف الحر لأنبوب المدخل المائي.

كرر لأنبوب مدخل الزيت. حرك الجهاز وقم بتوصيل الأنبوب بمرحلة المجهر باستخدام محاذاة موضوعية 20 مرة والتركيز على فوهة الجهاز. اضبط المجهر يدويا لإضاءة كوهلر لتوفير الإضاءة المثلى في المستوى البؤري.

باستخدام برنامج الكاميرا عالية السرعة ، يمكنك اقتصاص مجال الرؤية حول الفوهة للسماح بمعدلات إطارات أعلى ثم قم بتعيين معدل الإطارات ووقت التعرض وإعدادات الكاميرا الأخرى كما هو مطلوب للتسجيل الأمثل. بعد ذلك ، املأ حقنة مليلتر واحدة بمحلول الطور المائي المختلط جيدا المعد مسبقا. املأ حقنة سعة ثلاثة ملليلتر بمحلول طور الزيت.

قم بإمالة إحدى المحاقن المملوءة عموديا وقم بالتمرير السريع لنقل فقاعات الهواء إلى مخرج المحقنة. اضغط ببطء على المكبس لفترة كافية لدفع الهواء إلى طرف المحقنة الذي يمسك المحقنة عموديا. قم بتوصيل المحقنة بإبرة المحقنة المعنية المرفقة بالفعل بالجهاز.

اضغط على المكبس لإجبار الهواء على إبرة الحقنة ، الحجم الميت حتى يتم دفع السائل عبر الأنبوب تقريبا إلى الجهاز ، وقم بتركيب المحقنة بإحكام على مضخة حقنة وإشراك كتلة المكبس. كرر التوصيلات للحقنة الثانية وقم بتثبيتها على مضخة حقنة ثانية على كل مضخة حقنة وقم ببرمجة كل مضخة. باستخدام بروتوكولات الشركة المصنعة ، اضبط معدلات التدفق الأولية على 50 ميكرولتر في الدقيقة لمرحلة الزيت وخمسة ميكرولتر في الدقيقة.

لبدء المرحلة المائية ، تنتظر المضخات دخول كل سائل إلى الجهاز وتملأ القنوات التي تدفع الهواء الميت المتبقي. قد يستغرق ذلك عدة دقائق باستخدام معدلات التدفق الأولية. راقب تكوين قطرات في الفوهة.

قم بزيادة معدل التدفق المائي ببطء لمراقبة ترتيب الجسيمات في قناة المحلول المائي الطويلة. نظرا لأن معدل التدفق لا يزيد من معدل التدفق إلى النقطة التي يتم فيها تشغيل نفث تيار السائل المائي عند الفوهة كما هو موضح في هذا المثال ، باستخدام ملاحظة فوهة توليد إسقاط مختلفة ، فإن التدفق غير المستقر والانخفاض غير المتسق موجودان هنا. إذا كان تركيز الجسيمات منخفضا جدا بحيث لا يوفر القطارات المتناوبة مع عدد قليل نسبيا من الجسيمات المفقودة ولم تكن العينة متطابقة مع الطفو ، فقم بإمالة مضخة المحقنة فعليا نحو مخرج المحقنة لتوفير الاستقرار التدريجي للجزيئات باتجاه منافذ المحقنة.

بمجرد حدوث الطلب المناسب ، اضبط معدل تدفق الزيت لضبط تردد التوليد وحجم القطرات. اضبط معدلات التدفق بشكل متكرر لتحقيق معدلات التغليف المطلوبة وأحجام الإسقاط. بمجرد تأكيد التغليف المنظم المستقر ، انقل أنبوب المخرج من خزان النفايات إلى خزان تجميع للاستخدام في المستقبل.

يمكن تحقيق تغليف الجسيمات أو الخلية المفردة والمزدوجة بكفاءة عالية. يعد استخدام هذا البروتوكول الموضح هنا نتيجة تمثيلية لتغليف الجسيمات المفردة بمعدل تدفق زيت يبلغ 60 ميكرولتر في الدقيقة ومعدل تدفق مائي يبلغ تسعة ميكرولتر في الدقيقة. لامدا ، متوسط عدد الجسيمات للسقوط هو 0.95.

يتراوح تباعد الجسيمات في اتجاه التدفق من 17 إلى 18 ميكرون للجزيئات المتناوبة المرتبة بالكامل. معدل توليد السقوط في هذا المثال هو 6.1 كيلو هرتز بمتوسط حجم قطرة يبلغ 24.4 بيكوليلتر. يقارن الرسم البياني كفاءة جسيمات تغليف القطرة لترتيب تغليف الجسيمات المفردة مع علامة الجمع.

على أساس الإحصاء ، فإن التغليف العشوائي لحجم عينة يبلغ 517 قطرة ، يبلغ متوسط جزء القطرات التي تحتوي على جسيم واحد 79.5٪ على عكس جزء التغليف العشوائي المتوقع البالغ 36.7٪ لوحظ أن جزء الجسيمات التي ينتهي بها المطاف في القطرات المغلفة بشكل صحيح هو 83.7٪ لحجم عينة مكون من 491 جسيما ، في حين أن كسر التغليف العشوائي كان 37.3٪ ، يتم تحقيق تغليف الجسيمات المزدوجة ببساطة عن طريق تقليل معدل تدفق الزيت إلى 30 ميكرولتر في الدقيقة مع الحفاظ على معدل التدفق المائي عند تسعة ميكرولتر في الدقيقة. هنا لامدا ، متوسط عدد الجسيمات لكل قطرة هو 1.8. على غرار تغليف الجسيمات الفردية.

يتراوح تباعد الجسيمات في اتجاه التدفق من 17 إلى 18 ميكرون للجزيئات المتناوبة المرتبة بالكامل. يبلغ متوسط حجم القطرات الأكبر 39.8 بيكوليتر وتشكلت بمعدل 3.8 كيلو هرتز مقارنة بالتغليف العشوائي. بالنسبة لحجم عينة يبلغ 383 قطرة ، فإن متوسط جزء قطرات التغليف المرتبة التي تحتوي على جسيمين هو 71.5٪ على عكس جزء التغليف العشوائي المتوقع بنسبة 26.8٪ لوحظ أن جزء الجسيمات التي تميل في القطرات المغلفة بشكل صحيح هو 79.5٪ لحجم عينة مكون من 689 جسيما ، بينما كان جزء التغليف العشوائي 33.4٪ مأخوذ.

تظهر هذه النتائج معا أن كفاءات تغليف الجسيمات المفردة والمزدوجة تتفوق على كفاءات التغليف العشوائية بأكثر من عاملين وتقلل بشكل كبير من عدد القطرات التي لا تحتوي على العدد المطلوب من الخلايا أو الجسيمات. يتم توضيح أهمية تركيزات الجسيمات أو الخلايا المناسبة لكفاءة التغليف العالية في هذا التشغيل التجريبي. في حين أن معدلات التدفق المائي للزيت والماء هي نفسها كما في تشغيل تغليف الجسيمات المزدوجة الموضح سابقا ، فإن متوسط عدد الخلايا لكل قطرة لامدا ينخفض إلى 1.57.

وبالتالي ، لا يحدث الترتيب الكامل ، وبالتالي تظهر ثقوب في القطارات تاركة قطرات الشمس مع جزيئات أقل من المتوقع. يوضح هذا الرسم البياني انخفاض كفاءة تغليف جسيمين بسبب انخفاض قيمة Lambda. بالنسبة لحجم عينة يبلغ 324 قطرة ، كان متوسط جزء القطرات التي تحتوي على جسيمين 55.9٪ مع ما يقرب من عدد قطرات الجسيمات المفردة مثل قطرات الجسيمات المزدوجة.

يشير هذا إلى أن Lambda يجب أن تكون مساوية أو قريبة من عدد الخلايا المرغوبة لكل قطرة لتعظيم الجسيمات أو الخلايا المغلفة بشكل صحيح مع القيمة الدقيقة ل lambda المختارة ، وفقا لما إذا كان عدد أقل أو أكثر من الخلايا لكل قطرة مقبولا. في هذا العرض التوضيحي ، نستغل عدم تطابق الطفو لتمكين التحكم في التركيز في الوقت الفعلي أثناء التجربة. ومع ذلك ، بالنسبة للتجارب طويلة المدى ، قد يكون من المستحسن مطابقة الطفو للحصول على نتائج أكثر اتساقا بعد تغليف الخلايا في قطرات مائية.

يمكن إجراء التجارب المعتمدة على الوقت في أنبوب الطرد المركزي أو تحت المجهر عن طريق إعادة حقن القطرات في مصفوفات الموائع الدقيقة.