السابقين التثقيف المجراة من الجامعة، تطوير الأمخاخ ذبابة الفاكهة

الهدف العام من هذا الإجراء هو زراعة أدمغة ذبابة الفاكهة واليرقة والتلاميذ بالكامل في بيئة خارج الجسم الحي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحديد ذبابة الفاكهة واليرقات والشرانة في المرحلة المناسبة أولا. بعد ذلك ، يتم تشريح الأدمغة بسرعة.

ثم يتم استزراع الأدمغة للفترة الزمنية المطلوبة عند 25 درجة مئوية. أخيرا ، يتم إصلاح الأدمغة المثقفة وتلطيخها وتركيبها وتصويرها. في النهاية ، تظهر النتائج أنه من الممكن تقليد التطور في الجسم الحي لجسم فطر الأوف من خلال تقنية ثقافة خارج الجسم الحي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أنه يمكننا الآن محاكاة الأنماط الظاهرية في الجسم الحي في جسم فطر ذبابة الفاكهة في بيئة ثقافة خارج الجسم الحي ، مما يسمح بتحليل عالي الدقة لديناميكيات العملية التنموية لزراعة أدمغة اليرقات. بعد تحضير وسط طازج كامل بالأنسولين ويعمل دايسون عند 500 ميكرولتر إلى طبق ثقافة خلية 12 ملم مع إدراج للعلاج من تعاطي المخدرات. قم بإعداد وسط كامل مع 100 ميكرومولار لكل من روسكو باتين وأولي موين.

أضف كمية صغيرة من الوسط إلى التشريح. راقب الزجاج باستخدام ملعقة صغيرة ، والتقط يرقات الطور الثالث المتجولة وضعها في زجاج الساعة. بعد ذلك ، باستخدام الملقط ، تمسك الطرف الخلفي لليرقة.

ثم باستخدام الرقم خمسة ، الملقط ، افتح الطرف الأمامي بعناية ، وقم بتشريح الدماغ بسرعة مع الحفاظ على الحبل العصبي البطني سليما. باستخدام أطراف الماصة المبللة مسبقا ، انقل الدماغ بعناية إلى طبق زراعة الخلايا المعد مسبقا. بعد ذلك ، اصنع غرفة مبللة وضع الطبق داخل الغرفة.

احتضان الدماغ عند 25 درجة مئوية لمدة تصل إلى 48 ساعة لزراعة أدمغة التلاميذ. ابدأ بوضع علامة على بوي الأبيض على القوارير. سجل هذه المرحلة على أنها صفر ساعة بعد تكوين ER أو PF بعد 1.5 ساعة.

أ PF أضف 500 ميكرولتر من الوسط الكامل إلى طبق ثقافة خلية 12 ملم مع إدراج. أضف كمية صغيرة من الوسط المحضر إلى زجاج ساعة التشريح. بعد ذلك ، باستخدام ملعقة صغيرة مبللة ، التقط معدات الوقاية الشخصية التي تم تحديدها مسبقا للتشريح وضعها في زجاج الساعة.

العذراء الأبيض على اليسار هو نقطة الصفر الزمنية ، وعلى اليمين يظهر 1.5 ساعة A PF. ثم أثناء الإمساك بالطرف الخلفي من البوي بزوج من الملقط ، استخدم ملقط الرقم خمسة لفتح الطرف الأمامي لعلبة الخادرة بعناية. ثم قم بإزالة الدماغ بسرعة مع الحفاظ على الحبل العصبي البطني سليما ومتصلا. بعد قطع الجزء العلوي من طرف بلاستيكي سعة 20 ميكرولتر ، بلل طرف الماصة واستخدمه لنقل أدمغة التلاميذ بعناية إلى أطباق متوسطة.

احتضنها عند 25 درجة مئوية للمدة الزمنية المطلوبة. بعد احتضان أدمغة اليرقات أو التلاميذ لطول الفترة الزمنية المطلوبة ، قم بإزالة الوسط وإضافة 500 ميكرولتر من 4٪ فورمالديهايد في المخزن المؤقت PBST. احتضنها لمدة 15 دقيقة ، ثم استبدلها بفورمالديهايد طازج مخزن 4٪ واحتضنها لمدة 15 دقيقة إضافية.

استخدم XPBS واحدا مع 0.5٪ Triton X 100 لغسل الأدمغة أربع مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما. بعد الغسيل الأخير ، احتضن العينات لمدة ساعة واحدة. في حجب الحل.

أضف الأجسام المضادة الأولية في محلول الحجب واحتضن عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي ، اغسل العينات باستخدام PBST أربع مرات لمدة 10 دقائق لكل منها. ثم احتضن الأجسام المضادة الثانوية في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات.

كرر خطوات الغسيل لتركيب الأدمغة للفحص المجهري. ابدأ بموازنتها وتركيب الوسط لمدة ساعة واحدة وقم بتثبيتها على شرائح زجاجية لمنع سحق العينات. ضع رقائق الزجاج على كلا الجانبين.

ثم ضع زلات الغطاء بعد إغلاق زلات الغطاء بطلاء الأظافر. قم بتخزين الشرائح في الظلام. يوضح هذا الشكل لوحة من أدمغة يرقات الطور الثالث من الذباب والذباب البري الذي يعبر عن مشتق سلبي مهيمن من CDK five أو CDK five dn ، وكلاهما يعبر عن الأكتين GFP في جسم الفطر أو الخلايا العصبية MB gamma كما هو موضح سابقا ، هناك منطقة في المحاور القريبة من الخلايا العصبية جاما من النوع البري التي تفشل في تجميع الأكتين GFP ، وبالتالي يظهر كمنطقة واضحة ويتراكم بروتين بشكل لفافي في المحاور فقط حتى الحدود البطنية لهذه المنطقة.

تشير الخطوط المنقطة إلى موقع MB الذي يبرز المنطقة الصافية المؤثرة وحدودها البطنية. في الذباب الذي يعبر عن CDK خمسة dn. المنطقة الصافية للأكتين غائبة ، وتنتشر لفافة اثنين أو سريعان من النشاط المناعي ظهريا عبر تلك المنطقة باستخدام الطريقة المعروضة هنا لزراعة أدمغة الذباب من النوع البري خارج الجسم الحي ، وقد عولجت بمزيج من المثبطات الدوائية ل CDK ، وخمسة نشاط ، و ROS ، وكوتين ، وإيني.

تظهر هنا لوحة من أدمغة اليرقات في الطور الثالث للتحكم والذباب البري المعالج بالمخدرات على غرار الذباب ، معبرا عن أدمغة CDK السلبية المهيمنة التي تم معالجتها بخمسة مثبطات CDK لمدة 24 ساعة تظهر الخسارة المميزة للمنطقة الواضحة والتحول بسرعة. يظهر خطان أبيضان حدوديان موضع النوع البري بسرعة. حدتان موضحتان هنا عبارة عن سلسلة تمثيلية من أجسام فطر ذبابة الفاكهة من صفر إلى 10 ساعات.

PF المسمى بالغشاء المستهدف. تشير MCD ثمانية أقواس GFP إلى الإسقاطات المتغصنة ل MB المشار إليها باسم الكأس قبل التحول. دورة محاور MB ظهريا بطنيا في حزم سميكة وتنشأ إشارة فلورية من الشجرة الشجيرية الكثيفة.

يظهر هذا العمود الأدمغة التي تم تشريحها في الوقت المشار إليه. لاحظ تقليم التشعبات في المنطقة المشار إليها بواسطة الأقواس بحيث تختفي إشارة التغصني الضبابية بحلول ست إلى ثماني ساعات من PF. تم تشريح الأدمغة في هذا العمود في ساعة الصفر A PF قبل الفعل الداخلي.

أشار Dyson spike و Cultured x vivo في الأوقات إلى عدم ظهور أي تقليم تنموي للتشعبات. بدلا من ذلك ، تستمر الإشارة الشجيرية عند 10 ساعات PF للتحايل على هذا PPR الذي تم تحديده عند صفر ساعة EPF ، ولكن تم تشريحه في 1.5 ساعة على PF ويتم استزراعه. يوضح هذا العمود سلسلة تمثيلية من أجسام فطر DLA هذه من صفر إلى 10 ساعات.

A PF كما هو الحال في العينات غير المزروعة ، لا يمكن اكتشاف الإشارة المتغصنة بمقدار ثماني ساعات PF. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية ثقافة الاحتفاظ بأدمغة روسلر خارج الجسم الحي. يجب أن تكون قادرا على عزل الأدمغة عن اليرقة في المرحلة المتأخرة أو PrepU البيضاء إما قبل أو بعد ارتفاع الهرمون الذي يلتزم بالتحول. يجب أن تكون قادرا بعد ذلك إما على تحليل المواد الثابتة عن طريق الفحص المجهري أو استخدام الأدمغة كمادة أولية للتصوير الحي.