مسلسل إثراء الجذعية والخلايا الاولية الظروف المناسبة (جان معايير الأمان) في الثقافة لاشتقاق على المدى الطويل الكبار ماوس خطوط SSC

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد ثقافات طويلة الأمد للفئران البالغة ، المنوية ، والجذعية ، والخلايا السلفية أو الخلايا الجذعية الجذعية الجذعية الجذعية الجذعية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير خلايا التغذية المعطلة منشطا أولا. بعد ذلك ، يتم تحضير تعليق خلايا الخصية عن طريق التفكك الأنزيمي لأنسجة الخصية البالغة.

ثم يتم طلاء خلايا الخصية فوق الخلايا المغذية للسماح لمستعمرات SSC بالتكون. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في انتقاء مستعمرات SSC المفترضة يدويا للاستزراع الفرعي في آبار الاستزراع الصغيرة. في نهاية المطاف ، يمكن تأكيد تجديد الخلايا طويلة المدى وتوسيع الخلايا الجذعية الجذعية على العديد من الممرات في المختبر عن طريق التلوين المناعي للعلامات المعبر عنها على نطاق واسع للخلايا الجرثومية أو بشكل أكثر تحديدا من الخلايا الجذعية الجذعية الجذعية للخلايا الجذعية على المدى الطويل ، وذلك من خلال التلوين المناعي

ومن خلال التحليل الوظيفي باستخدام زرع SSC في الجسم الحي. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن تحديد مستعمرات SSC الصغيرة عن طريق الفحص المجهري الطوري يمثل تحديا كبيرا. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات اختيار المستعمرة لأنه قد يكون من الصعب رؤية مستعمرات SSC على خلفية معقدة لأنواع الخلايا الأخرى الموجودة في المراحل السابقة من الثقافات.

للبدء في تحضير الخلايا المغذية عن طريق زراعة خلايا JK واحدة في طبق زراعة خلية 100 ملم مع 10 ملليلتر من وسط نمو المغذي المعقم بالمرشح. عندما تصل المزرعة إلى 95٪ من التقاء ، قم بتقسيم الخلايا بنسبة واحد إلى ستة إلى واحد إلى 10 عن طريق غسل الخلايا أولا مرة واحدة باستخدام PBS الذي لا يحتوي على الكالسيوم أو المغنيسيوم في Prewarm. جرب التربسين EDTA واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى 10 دقائق بحجم متساو من نمو المغذي.

متوسط يعطل التربسين ، ويجمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي عند 300 مرة G لمدة خمس دقائق. ثم أعد تعليق الخلايا في نمو المغذي. ألواح زراعة الخلايا متعددة الآبار المتوسطة عن طريق إضافة محلول جيلاتين 0.4٪ كاف لتغطية حضانة البئر لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بإزالة أي صفيحة محلول زائدة حوالي 250 خلية لكل ملليمتر مربع في الألواح المطلية بالجيلاتين واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 24 ساعة. بعد ذلك ، قم بإزالة وسط الثقافة من الآبار. ثم قم بتعطيل نمو الخلايا عن طريق إضافة محلول جديد من mitomycin C. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات.

بعد ذلك ، قم بإزالة محلول الميتومايسين C من الخلايا واغسلها ثلاث مرات باستخدام DMEM. بعد إزالة غسل DMEM النهائي ، أضف ما يكفي من وسط الخلايا الجذعية لمنع جفاف المغذيات أثناء التعبئة. أضف SSCs في نفس اليوم بعد حصاد خصيتين الفئران البالغة بطريقة معقمة مؤقتا.

قم بتخزينها في طبق بتري مغطى وضعها على الفور على الثلج لمنع الجفاف والحفاظ على صلاحية الخلية في غطاء زراعة الخلايا. باستخدام ملقط دقيق معقم ومقص ناعم ، قم بعمل شق عرضي في الغلالة أبيا دون تقاطع الخصيتين تماما واستخدم الملقط للضغط على الأنابيب المنوية في زاوية من اللوحة مع إبقاء اللوحة على الجليد. استخدم مقصا زنبركيا ناعما لسك الأنابيب بسرعة لمدة ثلاث دقائق على الأقل لكل زوج من الخصيتين.

اجمع شظايا الأنابيب في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر واغسلها في حوالي 40 مل من BSA المبرد بنسبة 1٪ في جهاز الطرد المركزي PBS عند 60 مرة G لمدة 10 دقائق. لفصل شظايا النبيبات عن المنوية والحطام ، تخلص من المادة الطافية لكل زوج من الخصيتين. يعلق Resus الحبيبات في ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت للتفكك الدافئ الحر.

ضع الأنبوب المخروطي أفقيا في رف في شاكر مضبوطا على 150 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. لتعظيم التحريض. قم بالدوران عند 60 مرة G لمدة 10 دقائق لفصل الخلايا المفردة عن القطع غير المرتبطة.

اجمع المادة الطافية في أنبوب مخروطي منفصل سعة 15 مليلتر يحتوي على ثلاثة ملليلتر من DMEM 10٪ FBS لتحييد المخزن المؤقت للتفكك. ضع الأنبوب على الجليد مؤقتا ، وقم بإخضاع القطع غير المرتبطة مؤقتا لجولة أخرى من التفكك ، متبوعا بالتحييد ودمج الأنبوب الأول مع جهاز الطرد المركزي للأنبوب الثاني لمدة خمس دقائق عند 300 مرة. جي ريسوس.

الحبيبات في وسط الخلايا الجذعية بحجم 16 مل لكل لوحة خصية. ملليلترين من تعليق الخلية لكل بئر في صفيحة من ستة آبار تحتوي على خلايا مغذية. تعطيل انقسام مع ميتومايسين C.احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون بعد 48 ساعة.

استنشق الوسط. أضف ملليلترين من الوسط الطازج وأعد العينات إلى الحاضنة. بعد 48 ساعة.

أضف 0.5 مل من وسط الخلايا الجذعية الطازجة إلى كل بئر وأعد إلى الحاضنة بعد 48 ساعة إضافية. قم بتغذية الخلايا ثلاث مرات في الأسبوع على النحو التالي ، حتى تظهر مستعمرات كبيرة سرية تزيد عن 50 خلية للتغذية الروتينية والتغذية الواحدة. اثنان. قم بإزالة ما يقرب من 50٪ من الوسط وأضف حجما مكافئا من الوسط الطازج للثالث. إطعام.

استنشق كل الوسط تحت مكان به ملليمترين من الوسط الطازج. بعد استبدال الوسط بممر متوسط للخلايا الجذعية الطازجة ، تستخدم الخلايا أولا أهدافا 10 × و 20 × لتحديد المستعمرات مع المجهر غير المركز قليلا. ستظهر مستعمرات SSC على حافة البئر على شكل كتل مشرقة متجانسة تتكون من العديد من الخلايا التي يبلغ قطرها من 11 إلى 12 ميكرون والتي يصعب أو يستحيل فيها تمييز حدود الخلية الفردية.

نظرا لأن الخلايا تبدو مدمجة معا ، فقد تبدو المستعمرات غير SSE أغمق أو أكثر حبيبات أو أقل تجانسا مع حدود يمكن تمييزها. باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر مع إرسال رجل الماصة إلى 50 ميكرولتر ، خذ الوسط من البئر وطرده لتبليل الطرف. ثم باستخدام الحافة ، قم بدفع المستعمرة برفق قبل سحب 50 ميكرولترا من الوسط بسرعة لإخراج المستعمرة عن طريق الشفط في الطرف ، وطرد الوسط الذي يحتوي على المستعمرة في بئر واحد من صفيحة 48 بئر تحتوي على خلايا مغذية معطلة مع 100 ميكرولتر من وسط الخلايا الجذعية.

أضف ما يصل إلى ثماني مستعمرات إلى نفس البئر دون تجاوز 500 ميكرولتر لكل بئر وقم بإعداد آبار إضافية من لوحة 48 بئر. مع مرور مستعمرات SSC واحدة في سبعة إلى 14 يوما ، أو بعد ظهور كتل كبيرة تصل إلى 500 ، ستكون الآبار جاهزة للانقسام إلى خلايا الزراعة الفرعية التي تمر. واحد على الخافتات الطازجة.

استخدم طرف ماصة سعة مليلتر واحد لتقطيع مستعمرات البئر شبه الملتقى عن طريق غسل الوسط برفق عبر الخلايا لفك المستعمرات مع عدم إزعاج خلايا التغذية غير المرغوب فيها. اجمع الخلايا الثلاثية في أنبوب مخروطي الشكل وجهاز طرد مركزي عند 300 مرة G لمدة خمس دقائق. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في وسط الخلايا الجذعية الطازجة عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل لتعطيل المستعمرات.

لوحة SSCs على خلايا التغذية المعدة حديثا المعطلة مع mitomycin C كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو ، وتقسيمها بنسبة واحد إلى اثنين للممرات الثلاثة الأولى ثم واحد إلى أربعة إلى واحد إلى ستة. بعد ذلك ، استخدم جدول التغذية الثلاث في الأسبوع كما هو موضح سابقا. يجب أن تتلاقى الصفائح بعد سبعة إلى 10 أيام بعد خمسة إلى سبعة مقاطع.

يجب أن تتكون الثقافات من أكثر من 98٪ الخلايا الجرثومية الموضحة هنا هي ممر. تتكون مستعمرات SSC البالغة من النوع البري الصفري بعد سبعة أيام ، تتكون مستعمرات ثلاثية الأبعاد من طبقة من الخلايا المسطحة متصلة بالمغذيات أو المصفوفة الأساسية خارج الخلية التي ترسبها المغذيات مع طبقات متعددة من SSCs تنمو في الأعلى. في حين أن الخلايا الجذعية الجذعية السليمة عبارة عن بلاط ينكسر بشكل ساطع ، وقطرها بشكل موحد من 11 إلى 12 ميكرون ، يصعب تمييز حدود الخلية ، وقد يكون حجم المستعمرات متغيرا للغاية ، سواء داخل البئر أو بين الآبار المحضرة من فئران مختلفة.

لاحظ أن مورفولوجيا الخلايا المغذية ستتغير تدريجيا بعد التحول من DMEM 10٪ إلى وسط زراعة الخلايا الجذعية بعد التعطيل باستخدام mitomycin C. تظهر هنا مستعمرات كبيرة من أكثر من 50 خلية يتم نقلها يدويا إلى بئر جديد. الهيكل الأسود هو طرف الماصة للمقارنة. يتم عرض خلايا التغذية JK one المعطلة هنا.

بدون SSCs ، ستكون المستعمرات الكبيرة المعبأة بإحكام موجودة قبل الزراعة الفرعية الروتينية كما هو موضح في هذه الصورة وربما مثبتة بإحكام أو فضفاض على السطح الأساسي. من خلال الممارسة ، يمكن جمع هذه المستعمرات عن طريق تصحيح اللوحة أو غسلها برفق دون تعطيل الخلايا المغذية بشدة. تحت المستعمرات التي تم جمعها يمكن تفكيكها ميكانيكيا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ، أو باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل زرع الخلايا الجذعية للحيوانات المنوية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل أي جزء من الخلايا الجرثومية ضمن مجموعة معينة من ظروف الثقافة يمثل SSCs وظيفية أصيلة في الجسم الحي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، سيكون لديك فهم جيد لكيفية التعرف على المستعمرات بصريا وإنشاء ثقافات طويلة الأجل.