استهدفت وصفها من الخلايا العصبية في المجال الوظيفي محددة من القشرة المخية الحديثة مايكرو من خلال الجمع بين الإشارات الجوهرية والتصوير ثنائي الفوتون

الهدف العام من هذا الإجراء هو استهداف المجالات الدقيقة بدقة في خريطة وظيفية لدراسة بنية ووظيفة الخلايا العصبية بدقة عالية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إجراء تصوير إشارة جوهرية أولا على مساحة كبيرة من القشرة للحصول على خريطة لميزة التحفيز ذات الأهمية. الخطوة الثانية هي تحديد الموقع الدقيق في الخريطة الذي سيتم استهدافه بدقة عالية لتصوير الفوتون.

بعد ذلك ، بعد وضع الماصة المحملة بصبغة الفلورسنت بعناية ، يتم تمييز الخلايا العصبية بعلامة الفلورسنت. أخيرا ، يتم جمع صور عالية الدقة للفوتون للاستجابات أو الهياكل العصبية. في النهاية ، يمكن استخدام خريطة ميزة الإشارة الجوهرية للعثور على منطقة ذات أهمية ، مثل تفرد دولاب الهواء التوجيهي الذي يمكن استهدافه بعد ذلك للدراسة بدقة خلية عصبية واحدة.

الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه يمكن للمرء تصوير القشرة بمقاييس مكانية مختلفة باستخدام نفس إعداد المجهر مع عدد قليل من التعديلات السريعة على النظام. يسمح هذا للمرء بدمج هذه التقنيات لاستخدام خريطة الإشارة الجوهرية لدقة الدورة التدريبية كدليل لاختيار منطقة من الخلايا العصبية لتسميتها باستخدام مجسات الفلورسنت للتصوير عالي الدقة. تم تخدير وفقا لبروتوكول معتمد من لجنة رعاية المؤسسية ، وتم الكشف عن الجمجمة وتنظيفها.

تم استخدام مزيج الأسمنت للأسنان لربط لوحة رأس من الفولاذ المقاوم للصدأ بفتحة مستطيلة في المنتصف بالجمجمة. تعمل الغرفة المعدنية الموجودة أعلى لوحة الرأس كخزان للتصوير باستخدام العدسة الموضوعية الغمر في الماء. تم تأمين لوحة الرأس على مرحلة XY باستخدام أعمدة معدنية.

استخدم مثقاب الأسنان لتخفيف مساحة كبيرة من العظام داخل الفتحة المستطيلة للوحة الرأس. لازم تطبيق شموع العظام لوقف النزيف العرضي. يجب أن تمتد المنطقة الرقيقة خارج حدود حج القحف المخطط له.

ثم قم بحفر مخطط مربع بحجم اثنين في ملليمترين في العظم لحج القحف. اشطف الحجرة بشكل دوري بسائل نخاعي دماغي صناعي جديد لإزالة شظايا العظام وتقليل تبديد الحرارة إلى القشرة الأساسية. الآن ، ارفع العظم بالملقط رقم ثلاثة.

استخدم ملقطا رقميا خمسة ومقص زنبركي فانا لإزالة الطبقات العليا من الجافية ، مع ترك الطبقة السفلية سليمة. الطبقة الأخيرة من الجافية شفافة ويجب أن تكون أوعية التقشير مرئية بوضوح من خلالها. ضع قطرة من 2٪ من الأيروس الدافئ المذاب في السائل الدماغي النخاعي وضع على الفور غطاء زجاجي فوق حج القحف.

أولا ، رغوة جل مبللة بالسائل الدماغي النخاعي حول الجزء الخارجي من زجاج الغطاء لمنع agros من الجفاف أثناء تصوير الإشارة الجوهرية. ثم قم بتوصيل كاميرا CCG لتصوير الإشارة الجوهرية بمنفذ التثبيت C القياسي أعلى مجهري الصور وضع مصدر ضوء مضيء على طاولة الهواء بالقرب من موضع المرحلة XY وقم بتأمين دليل الضوء فوق حج القحف. اسحب ثنائي اللون الأساسي والمرآة أسفل منفذ الجبل البحري بحيث يمر الضوء الأحمر المنعكس اللازم للإشارات الجوهرية مباشرة من حج القحف إلى كاميرا CCD.

أدخل مرشح الأشعة تحت الحمراء في مسار الضوء لمنع القشرة من التسخين. ثم ضع مرشحا يمر بالضوء الأخضر وسجل صورة مرجعية رقمية للأوعية الدموية السطحية القشرية. بعد ذلك ، حرك تركيز Z إلى 500 ميكرون تحت السطح القشري.

استبدل المرشح الأخضر بمرشح أحمر لإضاءة القشرة لقياس الإشارات الجوهرية. تأكد من أن القشرة مضاءة بشكل موحد. قم بحماية حج القحف من الضوء الناتج عن عرض التحفيز البصري وتقديم سلسلة من المحفزات البصرية وتسجيل صور بيانات الانعكاس لإنشاء خريطة اتجاه في غضون 10 دقائق ، اجمع البيانات المقابلة لأربعة تكرارات لسلسلة من ثمانية محفزات بأربعة اتجاهات واتجاهين لكل اتجاه.

الآن قم بتحليل بيانات الإشارة الجوهرية لإنشاء خريطة ألوان اتجاه خاطئ كما هو موضح هنا. ثم حدد المناطق المستهدفة المحتملة لتصنيف الفوتونين للخلايا العصبية. على سبيل المثال، تفرد دولاب الهواء الاتجاهي تشير إلى الخريطة حيث تتلاقى جميع الاتجاهات المفضلة.

بعد ذلك ، قم بتراكب خريطة الاتجاه وصورة الأوعية الدموية السطحية القشرية واستخدم تخطيط المجالات الوظيفية وموقع الأوعية السطحية الكبيرة لتحديد الهدف ، وتجنب المواقع ذات الأوعية الدموية الكبيرة والشرايين. قم بإعداد محاليل الفلورسنت D واسحب ماصة مستدقة طويلة وفقا للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب. قم بتحميل خمسة ميكرولترات من خليط الصبغة في الماصة.

ثم قم بإزالة الطبقة النهائية من الجافية لتسهيل إدخال الماصة والحصول على صورتين فوتونيين بأعلى جودة كما هو موضح في هذا الرسم التخطيطي. يجب دفع الماصة إلى القشرة بزاوية 30 درجة لتمريرها بين الغرفة والهدف. لذلك، لن يكون موقع السطح القشري لموضع دخول الماصة مباشرة فوق منطقة الاهتمام المستهدفة.

على سبيل المثال، لتسمية منطقة مستهدفة بمقدار 200 ميكرون تحت السطح القشري، سيكون موضع دخول الماصة على سطح القشرة حوالي 350 ميكرون جانبيا للموضع المستهدف. حرك مرحلة XY لتوسيط موضع دخول السطح القشري أسفل الهدف 20 × أو 40 ×. بمجرد توسيط موضع الدخول أسفل الهدف ، ارفع الموضع Z للهدف بمقدار ملليمترين.

ثم قم بتشغيل ضوء التألق epi الأخضر ، وتصور صبغة Alexa الحمراء في الماصة وحرك الماصة حتى يصبح الطرف فوق موضع دخول السطح القشري. أثناء عرض طرف الماصة من خلال نظارات المجهر بإضاءة المجال الساطع، اخفض الماصة حتى يصل الطرف إلى موضع الدخول المطلوب على سطح القشرة. بعد ذلك ، قم بإزالة الهدف واستخدم رماح الامتصاص الخالية من النسالة لامتصاص السائل النخاعي الدماغي الزائد من حج القحف وتجفيف العظم المجاور.

ثم ضع قطرة من 3٪ الدافئة ، مذابة في السائل الدماغي النخاعي لتثبيت القشرة. بمجرد أن تصلب aros ، أدخل هدفا 40 × وأعد ملء الغرفة ب CSF. بعد ذلك ، استخدم المحور القطري للمناور الدقيق لتحريك الماصة حتى يصل الطرف إلى العمق المطلوب في القشرة.

ستقلل نفخات طرد الضغط العرضية لخليط DI من احتمالية انسداد طرف الماصة عندما تصل الماصة إلى الطبقة الثانية ، وستضيء ثلاث نفخات صغيرة من خليط DI المساحة الخلوية الإضافية وتكشف عن مجموعة كثيفة من أجسام الخلايا الدائرية كظلال داكنة لتحميل الأجسام العصبية في كرة من القشرة التي يبلغ قطرها 300 إلى 600 ميكرون. حقن خليط Dix في الفضاء خارج الخلية باستخدام 30 إلى 90 نبضة. كل نبضة ثانية واحدة ، ثانيتان إلى 10 رطل لكل بوصة مربعة.

بعد اكتمال الحقن، انتظر بضع دقائق، ثم قم بإزالة الماصة والهدف. سيتم امتصاص مؤشر الكالسيوم الفلوري بالكامل بواسطة الخلايا العصبية في غضون ساعة واحدة. أخيرا ، قم بإزالة aros المستخدمة للتنزيل وشطف غرفة التسجيل.

ضع قطرة صغيرة من اثنين إلى 3٪ نشأت على السطح وقم بوضع غطاء زجاجي بسرعة فوق حج القحف. أدخل هدفا عاليا NA 20 x في حامل الهدف وأعد توسيط المنطقة القشرية المسماة تحت الهدف. باستخدام مرحلة XY ، قم بحماية حج القحف من مصادر الضوء الدخيلة وجمع صور عالية الدقة للخلايا العصبية المصنفة في الجسم الحي.

بدلا من ذلك ، يمكن استخدام التثقيب الكهربائي للخلية المفردة لدراسة التشكل التغصني أو التصوير الوظيفي للتشعبات. في هذه المنهجية ، يتم إعداد DI وفقا للبروتوكول المكتوب. ثم في النقطة المناسبة من الإجراء، يتم وضع طرف الماصة بجوار غشاء جسم الخلية العصبية ويتم استخدام محور لتطبيق نبضة واحدة إلى ثلاث نبضات.

يتم تصور الملء الفوري للخلايا العصبية بالصبغة بسهولة باستخدام اثنين من المجهري الفوتون. تظهر هذه الصورة منطقة مصورة بفوتونين تظهر أجسام الخلايا المسمى بمؤشر الكالسيوم الفلوري OGB 1:00 صباحا في طبقة القشرة البصرية الثانية ثلاثة ، يمثل شريط المقياس 100 ميكرون. توضح هذه الصورة تفضيل اتجاه أجسام الخلايا العصبية الفردية من نفس الموقع الموضح في الصورة السابقة.

تظهر خريطة منظمة لاتجاه التحفيز المفضل حول تفرد دولاب الهواء الذي كان متمركزا في المنطقة المصورة. هنا نرى خريطة الاتجاه التي تم الحصول عليها بتصوير الإشارة الجوهرية. يتوافق المربع الأسود مع المنطقة الموضحة في صورتي الفوتون السابقتين.

تظهر هذه الصورة التشعبات وجسم الخلية لخلية عصبية واحدة متراكبة مع خريطة الاتجاه. تم تزويد الخلايا العصبية بالكهرباء باستخدام طابق Alexa 5 94 تحت توجيه فوتونين. كما تم جمع المكدس Z في الجسم الحي وتم تتبع العمليات المتغصنة في وضع عدم الاتصال باستخدام العصبية الواضحة كبرنامج.

تم الحصول على خريطة التوجيه باستخدام تصوير الإشارة الجوهرية قبل التثقيب الكهربائي لخلية واحدة. يمثل شريط المقياس 100 ميكرون. يظهر هذا الإسقاط Z 10 ميكرون من الطبقة القشرية الأولى التشعبات القمية.

تظهر الأسهم الحمراء أشواكا على طول التشعبات بينما تظهر هذه الإسقاطات Z التي يبلغ وزنها 10 ميكرون من الطبقة القشرية الثانية ثلاثة تشعبات قاعدية مع أشواك يشار إليها بالأسهم الحمراء والمحاور المشار إليها بالسهام البيضاء. هذه الطريقة مفيدة لدراسة الخرائط الوظيفية في القشرة على نطاقات مكانية مختلفة ولاستهداف الخلايا العصبية بدقة في مجال معين من الاهتمام. داخل الخريطة ، أظهرنا تطبيق طريقة فحص الخرائط الانتقائية للاتجاه ، ولكن يمكن تمديدها لتشمل خرائط الميزات المرئية الأخرى مثل شبكية العين ، والتوبي ، وهيمنة العين ، والاتجاه ، أو إلى الطرائق الحسية الأخرى التي لها خرائط منظمة وظيفيا مثل تلك التي تشفر الإحساس أو الاختبار.