مناعي لونين كفاءة استخدام كميات محدودة من الكتلة الحيوية
May 1st, 2013
نحن تصف طريقة قوية لونين مناعي باستخدام خلايا T الأولية. تأسست هذه الطريقة على النهج القياسية، ولكن يستخدم مجموعة محددة من الظروف والكواشف التي تعمل على تحسين كفاءة لكميات محدودة من الخلايا. الأهم من ذلك، يتم تقديم وصفا مفصلا لمرحلة تحليل البيانات.
الهدف العام من التجربة التالية هو اكتشاف ارتباط بروتينات ربط الحمض النووي مثل عوامل النسخ أو تعديلات الحص. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير الكروماتين أولا كخطوة ثانية. يتم إعداد تفاعل الترسيب المناعي للكروماتين لسحب أجزاء من الحمض النووي المرتبطة بالبروتين محل الاهتمام.
بعد ذلك ، يتم تضخيم جزء الحمض النووي المرتبط بالبروتين محل الاهتمام بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تم الحصول على النتائج التي تظهر إثراء الطي لجزء الحمض النووي المرتبط بالبروتين ذي الأهمية مقارنة بالمنطقة غير المنضمة بناء على تحليل QPCR. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات النسخ والكروماتين وعلم التخلق ، مثل متى وأين توجد بروتينات معدلة أو غير معدلة مختلفة.
على الحمض النووي على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتنظيم جينات الخلايا التائية. يمكن أيضا تطبيقه على أنظمة أخرى مثل الخلايا الليمفاوية البائية وعينات سرطان الدم وخطوط الخلايا الخالدة. سيتم تحضير الكروماتين لهذه التجربة من قرص مضغوط ساذج للفأر الطحال أربع خلايا تائية.
لبدء هذا الإجراء ، أضف 37٪ فورمالديهايد إلى التركيز النهائي بنسبة 1٪ إلى معلق الخلايا التائية الأربعة في DMEM وقم بتأرجح برفق في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. سيؤدي ذلك إلى ربط مجمعات بروتين الحمض النووي. أوقف التشابك عن طريق إضافة جلايسين مولي واحد إلى تركيز نهائي يبلغ 125 مللي مولار.
استمر في التأرجح لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 200 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من PBS البارد المثلج الذي يحتوي على مثبطات الإنزيم البروتيني ، وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى ، واغسل الخلايا بهذه الطريقة لما مجموعه ثلاث مرات بعد الغسيل النهائي ، وتخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من محلول تحلل الخلايا الباردة المثلجة الذي يحتوي على مثبطات البروتياز.
انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 مل واحتضانه على الجليد لمدة 15 دقيقة. اجمع النوى عن طريق الطرد المركزي عند 200 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص بعناية من المادة الطافية ، وأعد تعليق النوى في 500 ميكرولتر من التحلل النووي.
يحتضن المخزن المؤقت الذي يحتوي على مثبطات الإنزيم البروتيني على الجليد لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، صوتنة الخلايا باستخدام مسبار 1.6 ملم ومستوى إخراج من أربعة صوتنة لمدة 15 ثانية. قم بتبريد العينة على الثلج لمدة دقيقة إلى دقيقتين لمنع ارتفاع درجة الحرارة والصوتنة مرة أخرى لمدة 15 ثانية.
كرر الصوتنة والتبريد لما مجموعه أربع مرات من أجهزة الطرد المركزي ، الكروماتين الصوتي عند 16 ، 000 جم لمدة خمس دقائق. عند أربع درجات مئوية. اجمع المادة الطافية الشفافة في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
قم بإزالة كمية 20 ميكرولتر من المادة المطفية الشفافة. أضف صبغة تحميل الحمض النووي وتحقق من الحمض النووي الصوتي عن طريق الرحلان الكهربائي من خلال هلام زراعي 2٪. الحجم المثالي للحمض النووي الصوتي لمعظم التطبيقات هو 200 إلى 500 زوج أساسي.
أخيرا ، حدد تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية. يمكن استخدام الكروماتين المقص على الفور لإعداد تفاعل ترسيب مناعي للكروماتين أو تخزينه عند سالب 80 درجة مئوية للترسيب المناعي للكروماتين أو الكروماتين المخفف للرقاقة إلى تركيز الحمض النووي من خمسة إلى 10 ميكروغرام لكل مليلتر في حجم إجمالي يبلغ ملليلترين في مخزن مؤقت لتخفيف الرقاقة مع مثبطات البروتياز. يجب تنفيذ جميع الخطوات في هذا الإجراء عند صفر إلى أربع درجات مئوية.
وفر 10٪ وهو 200 ميكرولتر في هذا المثال من الكروماتين الموضح بالصوتنة المخفف كمخزن إدخال على الجليد للعينة المتبقية من 450 ميكرولتر في كل من أربعة أنابيب ميكروفيو سعة 1.7 ملليلتر مصنفة على أنها تحكم في النمط المتماثل والجسم المضاد ذي الأهمية. إذا تم استخدام أجسام مضادة متعددة من نفس النمط المتماثل ، فسيكون التحكم في النمط المتماثل واحدا كافيا لإجراء هذا التحليل ، أضف ميكروغرامين إلى خمسة ميكروغرامات من الجسم المضاد المحدد اعتمادا على خصوصية الجسم المضاد المستخدم أو التحكم في النمط المتماثل إلى الأنابيب المعنية. هز الأنابيب طوال الليل عند أربع درجات مئوية للسماح بتكوين مجمعات الأجسام المضادة للكروماتين في صباح اليوم التالي.
أضف 25 ميكرولترا من حبات البروتين G المغناطيسية إلى كل خليط وصخور لمدة ساعتين على الأقل عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، ضع أنابيب fuge على حامل مغناطيسي لمدة 15 إلى 20 ثانية للسماح للحبات بالتجمع على الجانب الممغنط. قم بإزالة المحلول بعناية عن طريق الشفط دون إزعاج الخرز.
أضف ملليلترا واحدا من محلول الغسيل منخفض الملح وهز برفق لمدة خمس دقائق على المحول. اجمع الخرزات باستخدام الحامل المغناطيسي وقم بإزالة محلول الغسيل. أضف ملليلترا واحدا من محلول الغسيل منخفض الملح مرة أخرى وقم بالصخور برفق لمدة خمس دقائق.
بعد إزالة محلول الغسيل منخفض الملح ، أضف ملليلتر واحد من محلول الغسيل عالي الملح والصخور لمدة خمس دقائق. اجمع الخرزات باستخدام الحامل المغناطيسي وقم بإزالة محلول الغسيل. كرر الغسيل بمحلول غسيل عالي الملح.
بمجرد إزالة محلول الغسيل عالي الملح ، أضف ملليلترا واحدا من محلول غسيل كلوريد الليثيوم ، وصخوره لمدة خمس دقائق. اجمع الخرزات باستخدام الحامل المغناطيسي وقم بإزالة محلول الغسيل. كرر غسل كلوريد الليثيوم مرة واحدة.
أضف ملليلتر واحد من محلول TE وصخور لمدة خمس دقائق. اجمع الخرزات باستخدام الحامل المغناطيسي وقم بإزالة محلول الغسيل. قم بإزالة الحمض النووي من الخرزات بإضافة 250 ميكرولترا من الصخور العازلة الإيلوسي لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ماصة من EIT وحفظ هذه المواد في أنبوب fuge جديد 1.7 ملم. كرر مرة أخرى واجمع بين كل من elu ، وتخلص من الخرزات لعكس الروابط المتقاطعة. أضف إلى الحمض النووي المراوغ خمسة مولي كلوريد الصوديوم إلى تركيز نهائي يبلغ 0.3 مولار وميكرولتر واحد من الحمض النووي الريبي.
أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف إلى المدخلات المحفوظة مسبقا. لجعل الحجم 500 ميكرولتر لكل مدخل ، أضف كلوريد الصوديوم إلى 0.3 مولار ميكرولتر واحد من الحمض النووي الريبي ، و 10 ميكرولتر من 0.5 مولار EDTA 20 ميكرولتر من تريس مولي واحد ، ودرجة حموضة حمض هيدروكلوريك 6.5 وميكرولتر واحد من البروتيناز K. أغلق الأنابيب واحتضانها طوال الليل عند 65 درجة مئوية في كتلة تسخين جافة في صباح اليوم التالي ، دع الأنابيب تبرد إلى درجة حرارة الغرفة. ثم أضف ملليلتر واحد من الإيثانول بنسبة 100٪ واحتضنه لمدة ساعتين إلى الليل عند سالب 80 درجة مئوية.
لترسيب جهاز الطرد المركزي للحمض النووي ، تنقل الأنابيب عند 16 ، 000 جم لمدة 15 دقيقة. لتكبيل غسل الحمض النووي ، حبيبات الحمض النووي مرة واحدة مع 70٪ من الإيثانول وتجف في الهواء ، يتم تعليق الحبيبات ، وحبيبات الحمض النووي في 100 ميكرولتر من الماء المقطر الأوتوكلاف ، وتنقية الحمض النووي باستخدام قوارب الكاياك ، وأعمدة الدوران السريع والتخلص منها بحجم إجمالي يبلغ 50 ميكرولتر مخزن مؤقت للشطف. هذا الحمض النووي جاهز الآن للاستخدام لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
ويعدتحليل احتياطيات QPCR للحصول على التخصيب الكامل لمنطقة مراقبة غير مقيدة هو أهم جانب من جوانب هذا البروتوكول. باستخدام برنامج QPCR ، انتقل إلى المحرر وقم بتمييز الآبار التي تحتوي على عينات إدخال من تخفيفات مختلفة بقيم منحنى قياسية. قم أيضا بتسمية الآبار بعينات رقائق غير معروفة تماما كما تم وضع لوحة PCR.
يسمح استخدام منحنى قياسي لاستعاب كميات الحمض النووي في عينات محددة ونمط متماثل غير معروفة بتقييم ومطابقة جودة وكفاءة جميع مجموعات التمهيدي على نطاق التركيزات الموجودة في العينات. انتقل إلى محرر المجموعة الفرعية وحدد المجموعات الفرعية ، بما في ذلك الآبار التي تحتوي على عينات الإدخال بالإضافة إلى عينات الرقائق غير المعروفة. سيتم قياس العينات غير المعروفة باستخدام المنحنى القياسي المتولد من التركيزات المعروفة لعينات الإدخال للتحليل.
بعد اكتمال تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإجراء التحليل باستخدام كمية ABS. الحد الأقصى للمشتق الثاني. حدد المجموعة الفرعية للتحليل واضغط عليها. حسنًا.
اضغط على حساب، والذي سيولد المنحنى القياسي باستخدام التركيزات المعروفة لعينات الإدخال وسيعرض الكمية المطلقة من الحمض النووي الموجود في العينات غير المعروفة إذا كانت جودة الحمض النووي جيدة وإذا كانت الاشعال مرتبطة على وجه التحديد بالمنطقة المستهدفة ، يجب أن تكون كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل قريبة من اثنين. قم بإجراء تحليل منحنى الانصهار باستخدام TM الذي يستدعي نفس المجموعة الفرعية إذا كان ذلك متاحا. تشير الذروة الواحدة إلى أنه تم تضخيم منتج واحد محدد فقط.
يمكن أيضا اختبار تضخيم الحمض النووي المحدد عن طريق منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الكهربائي ، جنبا إلى جنب مع سلم الحمض النووي من خلال هلام AROS. ثم يتم تصدير البيانات التي تم الحصول عليها كملف نصي محدد بعلامات جدولة، والذي يمكن فتحه في Microsoft Excel لمزيد من التحليل. قسم كمية الحمض النووي للجسم المضاد المحدد مع التحكم في النمط الإسوائي للبادئات المستهدفة.
كرر هذه الخطوة لمنطقة التحكم التمهيدية. إذا تم استخدام أجسام مضادة متعددة من نفس النوع الإسموائي لترسبات مناعية مختلفة ، فقم بتطبيع كل منها بقيم من نفس التحكم في النمط المتابع. علاوة على ذلك ، إذا تم استخدام أزواج أولية متعددة مستهدفة ، فيجب استخدام كميات الحمض النووي من مجموعة إصلاح التمهيدي للتحكم الفردي لتطبيع كل هدف.
تمثل قيم الإخراج تخصيب طية الترسيب المناعي المحدد للجسم المضاد في كل موقع بالنسبة للأجسام المضادة غير المحددة ، ويقسم الترسيب المناعي في الخلفية تخصيب الطية للبادئات المستهدفة مع إثراء الطية لبادئات منطقة التحكم للحصول على التخصيب بالنسبة لمنطقة التحكم غير المرتبطة. الأهم من ذلك ، لاحظ أنه نظرا لتوليد المنحنيات القياسية مع إجمالي الحمض النووي المدخل لكل عينة ، فإن كل قيم من قيم الترسيب المناعي التي تم إقحامها من المعيار يتم تطبيعها بالفعل والتعبير عنها كجزء من إجمالي المدخلات بواسطة برنامج الآلة. أظهر بروتوكول الترسيب المناعي للكروماتين هنا ضوابط للاختلافات ، إن وجدت ، في كمية الحمض النووي المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل من خلال استخدام زوج أولي يضخم منطقة غير مرتبطة من الجينوم ، وبالتالي يعمل كعنصر تحكم في التحميل.
في هذا المثال ، تم استخدام منطقة الترميز لجين بيتا أكتين الفأر كمنطقة غير مرتبطة بالبروتين محل الاهتمام وعامل النسخ وموقع ربط الدهون على الفأر ، تم استخدام محفز IL two كمنطقة مستهدفة. توضح هذه اللقطة لجدول بيانات Excel استخدام بروتوكول الحساب الموصوف في بيانات التحليل من ثلاثة تكرارات تجريبية في المربعات الملونة باللون الأصفر والأخضر والأرجواني مع ثلاث نسخ مكررة تقنية. تم استخدام كل منها لحساب تخصيب الطية.
يمكن مقارنة التخصيب النسبي للبروتين المرتبط بمناطق مختلفة من الجينوم إذا تم اختيار نفس المجموعة من التحكم في النمط المتماثل والأجسام المضادة المحددة. إذا كانت خصوصية الجسم المضاد جيدة ، فعادة ما يتم ملاحظة تخصيب من ضعفين إلى عشرة أضعاف على منطقة التحكم غير المرتبطة. يوضح هذا الشكل نتائج تجربة رقاقة مع أربع خلايا تائية تقليدية وأربع خلايا تائية تنظيمية مضغوط معزولة من الفئران.
تم تحفيز جزء صغير من الخلايا التائية التقليدية باستخدام PMA و mycin الأيوني لمدة 30 دقيقة. لوحظ التخصيب النسبي لعوامل نسخ NFA ، N fat C واحد ، و NFA C اثنين في مروج IL الثاني ويتم تصويره هنا على أنه تخصيب طية على منطقة غير مرتبطة باتباع هذا الإجراء. يمكن استخدام طرق أخرى مثل ChIP-seq من أجل معالجة الإشغال العالمي لعوامل النسخ أو التغيرات على مستوى العالم في العلامات اللاجينية استجابة للتحفيز.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء الترسيب المناعي للكروماتين باستخدام عدد محدود من الخلايا ، وتحليل بيانات QPCI لتحديد نطاقات عامل النسخ مقارنة بمنطقة التحكم غير المنضمة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
الموجز
تقدم هذه المقالة طريقة قوية لتحليل المناعة الكروماتين (ChIP) باستخدام الخلايا التائية الأولية، مما يعزز الكفاءة لكميات الخلايا المحدودة. يتضمن وصفًا تفصيليًا لمرحلة تحليل البيانات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الكروماتين
- تنظيم النسخ
- علم التخلق
الخلفية
- تحليل المناعة الكروماتين هو تقنية تستخدم لدراسة تفاعلات البروتين-DNA.
- الخلايا التائية الأولية حاسمة لفهم الاستجابات المناعية.
- هناك حاجة لطرق فعالة للعمل مع عينات الخلايا المحدودة.
- تحليل البيانات حيوي لتفسير نتائج ChIP.
هدف الدراسة
- لكشف ارتباط بروتينات ربط DNA وتعديلات الهستون.
- لتحسين منهجية ChIP للخلايا التائية الأولية.
- لتوفير تحليل شامل للبيانات الناتجة.
الطرق المستخدمة
- تحضير الكروماتين من الخلايا التائية الأولية.
- إعداد تفاعل المناعة الكروماتين.
- تضخيم شظايا DNA المرتبطة بالبروتينات ذات الاهتمام باستخدام PCR.
- تحليل PCR الكمي (QPCR) لتقييم معدل التخصيب.
النتائج الرئيسية
- كشف ناجح لتفاعلات البروتين-DNA.
- تحسين الكفاءة في ChIP لكميات الخلايا المحدودة.
- تحليل مفصل لأحداث الربط وتعديلات الهستون.
- رؤى حول النسخ، الكروماتين، وديناميات التخلق.
الخلاصات
- تعزز الطريقة دراسة عوامل النسخ وتعديلات الهستون.
- توفر أداة قيّمة للباحثين في الكروماتين والتخلق.
- قد تشمل التطبيقات المستقبلية دراسات أوسع في بيولوجيا الخلايا المناعية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Chromatin immunoprecipitation (ChIP) enables target validation by mapping protein-DNA interactions, a critical step in de-risking therapeutic hypotheses. This protocol improves sensitivity and reproducibility for limited primary cell samples, supporting early discovery workflows where material is constrained. Quantitative analysis via standard curves and qPCR provides predictive confidence in binding specificity, informing go/no-go decisions in lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates transcription factor binding to specific genomic regions, clarifying mechanistic hypotheses.
- Operational Value: Enables functional validation of targets using limiting biomass, reducing reliance on large-scale cell culture.
- Predictive Value: Standard curve normalization allows quantitative comparison across conditions, supporting data-driven target prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces enriched DNA fragments suitable for PCR-based quantification, enabling reproducible readouts.
- Standardization: Use of input DNA standard curves controls for primer efficiency and sample variability, improving assay consistency.
- Scalability: Protocol adapted for low-input systems, facilitating screening in primary or rare cell populations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports biomarker-aligned studies by linking protein binding to functional genomic regions in disease-relevant models.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes specific binding from background using isotype controls and unbound genomic regions, reducing false positives.
- Preclinical Alignment: Enables chromatin state analysis in primary immune cells, relevant for immunomodulator target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, particularly when working with primary or limited primary cell samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by determining where and when proteins bind DNA in chromatin.
- Screening: Generates quantitative ChIP-qPCR data suitable for evaluating compound effects on protein-DNA interactions.
- Analytics: Absolute quantification via standard curves enables inter-sample comparison and statistical rigor.
- Translational Research: Connects binding events to functional outcomes in primary T cells, relevant for immune-targeted therapies.
- Enterprise Reuse: Standardized workflow allows reuse across antibody and target panels in discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in protein-DNA interactions, increasing confidence in target biology.
- Operational Value: Standardized lysis, immunoprecipitation, and wash steps improve reproducibility across users and sites.
- Strategic Value: Enables early de-risking of targets by confirming chromatin engagement, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Quantitative enrichment data supports risk-adjusted prioritization of targets for lead identification.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin handling, antibody validation, and qPCR data analysis.
- Dependent on sonication equipment for consistent chromatin shearing and magnetic separation tools for immunoprecipitation.
- Necessitates standardized reagent lots and antibody qualification to ensure reproducibility across experiments.
- Adaptation to different cell types may require optimization of crosslinking and lysis conditions.
- Limited by antibody specificity and the need for appropriate control regions to distinguish specific from nonspecific binding.
