A تعدد في منصة الفرز القائم على luciferase المراسل لاستجواب المرتبطة بالسرطان نقل الإشارة في الخلايا المستزرعة

الهدف العام من البروتوكول التالي هو تمكين استجواب وظيفة الجينات على نطاق الجينوم من خلال المراقبة المتزامنة لعدة مؤشرات خلوية. في هذا العرض التوضيحي، تُستخدم المراسلين المعتمدين على لوسيفيريز Firefly RAN و Cipro Dina لمراقبة نشاط مسارات P 53 WINT و KRAS على التوالي. يتم إدخال هذه المراسلين الثلاثة عن طريق التحول المشترك مع irna يستهدف جيناً معين الاهتمام في خلايا HCT one 16، وهي خط خلوي لسرطان القولون والمستقيم.

بعد ذلك، يتم قياس أنشطة لوسيفيراز اليراعة والفانيليا في نواتج تحلل الخلايا، بينما يتم قياس نشاط لوسيفيراز Cipro DEA، وهو إنزيم مفرز، في وسط الزرع. وتظهر النتائج التي تم الحصول عليها مدى تكرار نظام المقايسة، بالإضافة إلى القدرة على الكشف عن التأثيرات المشتركة والفريدة للجينات ضمن هذه المسارات الثلاثة ذات الصلة بالسرطان.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل microray أو multicolor pries في كونها وسيلة ميسورة التكلفة وشاملة وفعالة من حيث التكلفة لفحص نواتج النسخ الخلوي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على تساؤلات في أبحاث السرطان، مثل تطوير استراتيجيات علاجية تستهدف جزيئياً. ورغم أن بروتوكول عفن التعداء المؤقت الخاص بنا يقلل من IL والالتزام الزمني المسبق لإعداد الفحص، إلا أنه من المرجح أن يزيد من تباين الإشارة بين الآبار، وهو ما يمكن معالجته من خلال النظر في نسب التقارير بدلاً من النظر في القيم المطلقة من الآبار. لبدء هذا الإجراء، اغسل خمس أطباق بمساحة 10 centimeter squared تحتوي على خلايا HCT one 16 بـ PBS بنسبة تلاقي تتراوح من 80% إلى 90%، ثم قم بحصد الخلايا عن طريق trypsin ization لكل طبق.

استخدم 1 مل من محلول trypsin متبوعاً بمعادلته بـ 10 مل من DMEM يحتوي على 2% FBS و1% penicillin streptomycin. انقُل الخلايا المعلقة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل، ثم قم بالطرد المركزي عند 130 G تقريباً لمدة خمس دقائق. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق كتلة الخلايا في 10 مل من الوسط الزرعي.

قم بعدد الخلايا باستخدام عداد الخلايا، ثم قم بتحضير محلول خلوي بتركيز 10⁵ خلية لكل milliliter. احتفظ بـ 150 milliliters من معلق الخلايا للخطوة التالية باستخدام جهاز MultiDrop لتوزيع السوائل الآلي في طبق، بحيث يتم وضع 100 µL أو 10⁴ خلية في كل بئر من بئر طبق زراعة مكون من 96 بئراً.

يجب أن يكون معلق الخلايا في هذه الحالة كافياً لتغطية 1296 بئراً في الأطباق. تُحضن الأطباق التي تحتوي على الخلايا عند 37 °C في حاضنة تحتوي على 5% carbon dioxide أثناء تحضير خليط عفن الخلايا (transfection mixture). وقد تم عزل الحمض النووي لبناء المراسل (reporter construct DNA) عالي الجودة المستخدم هنا باستخدام أطقم MIDI prep القياسية، وخُفف ليصل إلى تركيز نهائي قدره 1 mg/mL.

لكل مراسل، قم بتحضير 100 µL من المحلول المخزون لبنية المراسل عن طريق دمج المكونات التالية: 30 µL من P 53, FL و 30 µL من eight X-T-C-F-R-L و 30 µL من elk one G و 4 µL من U-A-S-C-L و 4 µL من H₂O. سينتج عن ذلك خليط DNA بنسبة نهائية 1:1:1:0.2 من المراسلين وبتركيز DNA نهائي قدره 0.3 mg/mL. بعد ذلك، قم بتحضير خلائط ترانسفكشن I-R-N-A-D-N-A كافية لإجراء عملية الترانسفكشن لـ 1296.

يتم تخفيف 80 µL من المحلول المخزون لبنية المراسل (reporter construct) في 8 mL من منظم EC buffer من مجموعة QIAGEN effecting للحصول على محلول DNA بتركيز نهائي قدره 3 µg/mL لكل طبق. يتم توزيع 20 µL من محلول DNA في كل بئر من أطباق PCR ذات 96 بئراً. سيعتمد عدد الأطباق ذات 96 بئراً على عدد تجمعات irna المراد اختبارها.

على سبيل المثال، في هذه الحالة، سنحتاج إلى 4 أطباق ذات 96 بئرًا لإجراء التقييم. وباستخدام جهاز نقل السوائل الآلي Biome، يتم نقل 2 µL من كل siRNA بتركيز 5 µM إلى البئر المقابل في طبق PCR الذي يحتوي على مخزون DNA المخفف. بعد ذلك، يتم إضافة 1 µL من محلول المعزز (enhancer solution) إلى كل بئر في طبق DNA siRNA.

اترك تفاعل المُعزز ليحدث في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم أضف ثلاثة ميكرولتر (3 µL) من كاشف تحفيز عفن التحول إلى كل بئر، وحضّنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق إضافية. ولوقف تكوين معقد التحول، أضف 10 ميكرولتر (10 µL) من وسط DMEM الذي يحتوي على 2% FBS و1% penicillin streptomycin إلى كل بئر في لوحة PCR.

أخرج أطباق الـ 96 بئراً التي تحتوي على خلايا HCT 116 من الحاضنة. انقل 10 µL من خليط عفن الخلايا (transfection mixture) إلى كل بئر في طبق 96 بئراً يحتوي على الخلايا، حيث سيتم إجراء كل عملية عفن في ثلاث مكررات. سيتم تطبيق الخليط نفسه على طبقين إضافيين من أطباق الـ 96 بئراً التي تحتوي على الخلايا.

يُحضن الخلايا مع خلائط عفن التحول (transfection) عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة تحتوي على 5% ثاني أكسيد الكربون لمدة 36 ساعة. وبعد مرور 36 ساعة على عفن تحول الخلايا، تصبح أنشطة اللوسيفيراز (Luciferase) جاهزة للقياس.

بما أن هذه الدراسة تتضمن عدة مراسلين، أحدهم يُفرز في وسط الزرع واثنان آخران يتم التعبير عنهما في سيتوبلازم الخلية، فسيتم الحصول على القياسات من كل من وسط الزرع والتحلل الخلوي للكشف عن نشاط لوسيفيراز Cipro Dina أو نشاط CL في وسط الزرع. لوحة تكرارية للوسط.

أضف 20 µL من وسط الزرع إلى لوح أبيض معتم يحتوي على 96 بئراً. وباستخدام جهاز التوزيع المتعدد (multi drop)، أضف 20 µL من محلول منظمة مقايسة CL إلى كل بئر. بعد ذلك، أضف 10 µL من Cipro Dina Lucifer والركيزة إلى كل بئر، ثم قم بقياس نشاط CL باستخدام مقياس الضوء (luminometer) للكشف عن أنشطة firefly luciferase وvanilla luciferase؛ مع مراعاة ضرورة تحضير نواتج تحلل الخلايا أولاً.

قم بإزالة وسط الزرع من الخلايا عن طريق قلب كل طبق رأساً على عقب وتفريغ الوسط في حوض الغسيل. أزل ما تبقى من الوسط عن طريق النقر بلطف على الطبق المقلوب باستخدام مناشف ورقية. أضف 30 µL من محلول التحلل السلبي (passive lysis buffer) بتركيز 1x إلى كل بئر من آبار الخلايا.

ضع الأطباق على هزاز منصة مضبوط على سرعة متوسطة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد خمس دقائق، أضف 20 µL من كاشف مقايسة اللوسيفيراز إلى كل بئر من الخلايا، وقس فوراً نشاط لوسيفيراز اليراعة باستخدام مقياس الضيائية. بعد ذلك، أضف كاشف Stop and Glow لإخماد نشاط لوسيفيراز اليراعة ثم قم بقياس نشاط اللوسيفيراز.

قبل البدء بعملية التعددية، تم تقييم متانة منصات الفحص الثلاث المختلفة بشكل فردي. تم ترانسفكشن خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم المحددة بثماني بنى تقريرية مشفرة لـ XTCF PP 53 ta Luke أو ALK one Firefly Luciferase، جنباً إلى جنب مع مجموعات من siRNAs التي تستهدف WINT beta-Catenin P 53 أو KAS على التوالي. كما تم توضيح الأنماط الجينية ذات الصلة بالمسار لكل خط خلوي.

تم تقييم قوة كل منصة فحص من خلال مدى تكرار هذه التأثيرات المستحثة على مسار نقل الإشارة ذي الصلة. وكما هو موضح في هذه النتائج التمثيلية، فإن betaine وsiRNAs ليس لهما أي تأثير على نشاط مراسل eight XTCF في خلايا RKO. وهذا يتناقض مع خلايا DLD one وHCT one 16، والتي تفتقر على التوالي إلى مسار A PC، والبروتين الكابت، وتعبر عن شكل منشط من beca tenin.

بعد ذلك، تم توضيح إمكانية استخدام هذه المراسلين معًا لإجراء قياسات متزامنة لنشاط الجينات في مسارات نقل الإشارات لـ beta-catenin و P 53 و KRAS باستخدام مجموعات IRNA الموضحة في هذه الرسوم البيانية. وتظهر أنشطة اللوسيفيراز النسبية على المحور Y، بينما تظهر الـ siRNAs التي تستهدف الجين المعني الموضح على المحور X. على سبيل المثال، تؤدي مجموعة siRNA التي تستهدف beta-catenin إلى تقليل نشاط مسار beta-catenin، بينما لا تؤثر بشكل ملحوظ على مساري P 53 و KRAS.

أثناء محاولة تطوير نظام مراسل متعدد الإشارات، من المهم تحسين خط الخلايا المستهدف فيما يتعلق بمنطقة عفن التعديل (transfection region) وكثافة إشارة المراسل المطلوبة.