البروتين طريقة خالية من تنقية تجليد تحديد الانجذاب من قبل Thermophoresis الميكروسكيل
August 15th, 2013
thermophoresis الميكروسكيل (MST) يمكن استخدامها على نطاق واسع لتحديد تقارب ملزمة دون تنقية البروتين المستهدف من الخلية لست. البروتوكول ينطوي overexpression من البروتين GFP تنصهر، تحلل الخلية في غير تغيير طبيعة الظروف، والكشف عن إشارة MST في وجود تركيزات من يجند متفاوتة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد تقارب الارتباط لتفاعل ترابط البروتين دون تنقية البروتين من محللة الخلية. يتم تحقيق ذلك عن طريق التعبير أولا عن البروتين المنصهر في GFP ذي الأهمية في أي خط خلية ملتصق. بعد تحضير مخففات محللة الخلية والترابط ، يتم تحضير مخاليط تحلل الخلايا وتحميلها في الشعيرات الدموية.
بعد ذلك ، يتم قياس المقاومة الحرارية للبروتين المنصهر في GFP في وجود تركيزات ترابط متفاوتة. الخطوة الأخيرة هي تحليل بيانات الفصادة الحرارية المجهرية أو قياسات MST. في النهاية ، يتم استخدام المقاومة الحرارية الدقيقة لتحديد صلات الارتباط للتفاعلات بين البروتينات المنصهرة في GFP والروابط المختلفة.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطرق الحالية مثل المعايرة بالتحليل الحجمي أو قياس السعرات الحرارية أو البلازما السطحية هي أنها تتجنب تنقية البروتين ، وتبسيط وتسريع التوصيف الكمي للتفاعلات الثنائية بشكل كبير. تقدم هذه الطريقة مزايا كبيرة عند العمل مع البروتينات التي يصعب التعبير عنها وتنقيتها، مثل بروتينات الغشاء وعوامل النسخ. واحدة من أكبر مزايا الفصادة الحرارية المجهرية هي أنها تعمل في مجموعة متنوعة من المخازن المؤقتة وتتحمل وجود المنظفات وخلاياي في النظام ، وسيتم توضيح هذه التقنية كارين ستيفكا ، عالمة أحياء من مختبري لبدء غسل الخلايا لفترة وجيزة باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج أو PBS باستخدام 10 مل من المخزن المؤقت لكل قارورة T 75.
احتفظ بالخلايا على الجليد لمدة خمس دقائق أو حتى تبدأ في الانفصال عن القارورة. اكشط الخلايا باستخدام مكشطة الخلية لفصلها إذا لزم الأمر. أعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من PBS المثلج ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دائري ذو قاع دائري سعة 14 ملليلترا مبرد مسبقا.
حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 400 إلى 600 جي وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من محلول التحلل المثلج. انقل المعلق إلى أنبوب einor مبرد مسبقا سعة 1.5 مل لاستخراج بروتينات العصارة الخلوية.
ضع الخلايا على الجليد لتقليل ارتفاع درجة الحرارة المحلية والخلايا بثلاث مرات عشر نبضات ثانية من الصوتنة في سعة 30٪. باستخدام طرف ما قبل البرد من ملليمترين إلى ثلاثة ملم ، احتفظ بالحافة أسفل السطح لتقليل الرغوة. احذف هذه الخطوة عند استخدام المنظف الذي يحتوي على عازلة واحتضنه على الثلج لمدة 30 دقيقة.
بدلا من ذلك ، قم بتصحيح محلول المحللة ليحتوي على تركيز ملح فسيولوجي يبلغ 100 مللي مولار كلوريد الصوديوم إذا لزم الأمر من محلول مخزون من خمسة كلوريد صوديوم مولار. أخيرا ، اجمع المحللات عن طريق الطرد المركزي عند حوالي 25،000 جي وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. حدد الصمام الثنائي الباعث للضوء أو مصدر إثارة LED بطول موجي يساوي 470 نانومتر على أداة MST.
قم بتحميل الشعيرات الدموية بمستخلص الخلية المخفف مرتين و 10 مرات باستخدام المخزن المؤقت MST ووضعها في أداة MST. قم بإجراء عملية البحث عن الشعيرات الدموية على برنامج التحكم في أداة MST. يتراوح نطاق التألق الأمثل في المحللة المخففة من 400 إلى 1500 وحدة مضانة.
تابع لتحديد نطاق تركيز الترابط الأمثل كما هو موضح في بروتوكول النص. ضع رف أنبوبي بالعدد اللازم من أنابيب الطرد المركزي منخفضة الربط سعة 0.5 مل على ماصة الثلج 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت MST في قاع كل أنبوب عند 25 ميكرولتر من محلول مخزون الترابط إلى الأنبوب الأول وقم بإجراء تخفيف تسلسلي مزدوج للرابط باستخدام بقية الأنابيب. احتفظ بالرف مع عينات الترابط على الجليد.
احسب تخفيف محللة الخلية للحصول على المستوى الأمثل للبروتين المستهدف الفلوري في تفاعلات الربط. يجب أن يكون تركيز البروتين النهائي قريبا من ثابت تفكك الارتباط المتوقع أو أقل ، ويجب تعديله للحصول على العدد اللازم من أعداد التألق. في الحل النهائي ، تابع تخفيف محللة الخلية باستخدام MST Buffer.
ضع 0.5 ملليلتر أنابيب منخفضة الربط في رف الأنبوب عبر الأنابيب مع عينات التخفيف التسلسلي للترابط. أضف بعناية 15 ميكرولترا من محللة الخلية إلى قاع كل أنبوب. حاول ألا تلمس جدران الأنبوب لتجنب فقدان العينة.
أضف 15 ميكرولترا من عينة الترابط بأعلى تركيز إلى الأنبوب المقابل. رقم واحد ، مع محللة الخلية. تخلط جيدا وتغير طرف الماصة.
كرر هذه الخطوة مع بقية الأنابيب باستثناء الأنبوب الأخير ، والذي يجب ألا يحتوي على ترابط. أضف 15 ميكرولترا من المخزن المؤقت MST إلى الأنبوب الأخير واخلطه. املأ ما يقرب من ثلثي الشعيرات الدموية الأولى بخليط الربط من الأنبوب رقم واحد.
قم بإمالته لتحريك المحلول نحو المركز وضع الشعيرات الدموية على الدرج الشعري إلى الموضع. رقم واحد ، كرر هذه الخطوة مع بقية الشعيرات الدموية. يمكن توصيل النهايات الشعرية بالشمع لتجارب أطول.
ضع الدرج داخل أداة MST وأغلق باب الجهاز. بعد ذلك ، حدد مصدر الإثارة LED بطول موجي يساوي 470 نانومتر. في أداة MST ، قم بتنفيذ أمر البحث عن الشعيرات الدموية للسماح للأداة بالعثور على المواضع الدقيقة للشعيرات الدموية وقياس مضان العينات بناء على شدة إشارة الفلورسنت.
اضبط طاقة LED لإدخالها في الفاصل الزمني من 400 إلى 1500 وحدة. انقر فوق الزر "ابدأ" لإجراء تجربة المقاومة الحرارية. يمكن اختيار أكثر من طاقة ليزر بالأشعة تحت الحمراء للتجربة.
من أجل العثور على تدرج درجة الحرارة الأمثل لنظام معين ، يستغرق تشغيل مجموعة واحدة من 16 شعيرا دمويا من 10 إلى 12 دقيقة. اجمع البيانات من جولتين إلى ثلاث مرات لنفس مجموعة الشعيرات الدموية لضمان قابلية تكرار القياسات. لبدء تحليل البيانات ، افتح برنامج التحليل وقم بتحميل مجلد المشروع.
في عرض تشغيل المعلومات الظاهرة ، حدد أنه تم جمعه في منحنيات حرارية محددة لطاقة الليزر بالأشعة تحت الحمراء. كان هناك خيار لفتح جميع الآثار الحرارية التي تم جمعها في ظل ظروف مختلفة في وقت واحد ، ثم اختيار أي منحنيات للتحليل عن طريق تشغيلها وإيقافها. في نافذة الرسم البياني لنقاط التقييم ، حدد المقاومة الحرارية أو الفصادة الحرارية مع خطوطين أزرق وأحمر.
حدد منطقتين من المنحنيات التجريبية التي يتم تحديدها يدويا للتحليل بواسطة البرنامج. تأكد من وضع الخطين الأزرق والأحمر بشكل صحيح لتوفير أقصى تغيير في Thermal Resis. للحصول على متوسط النقاط مع الانحرافات المعيارية، حدد استخدام المتوسط أو تمييز عمليات التشغيل لعمليات تشغيل منفصلة.
لرسم ملاءمة ثابتة للتفكك ، حدد استخدام المتوسط ، وأدخل قيمة تركيز الجزيء المسمى وقم بإصلاحها وتناسب المنحنى. يظهر ثابت التفكك الملزم أو قيمة KD مع انحرافها المعياري في نافذة منبثقة منفصلة للمعلومات. احفظ متوسط بيانات الملاءمة في ملف نصي وانقلها إلى Excel.Heck.
تم استخدام 2 9 3 خلايا تعبر عن STAT 3G FP كمصدر للإحصائيات الثالثة المسماة بالفلورسنت. بالنسبة إلى ربط مقايسة ربط الحمض النووي لقليل النوكليوتيدات عالية الشحنة أدى إلى تغييرات كبيرة في حركة STAT الثلاثة. في تدرج درجة الحرارة.
يتم رسم إشارة الشبكية الحرارية كدالة لتركيز قليل النوكليوتيدات. تمثل كل نقطة بيانات متوسط ثلاثة قياسات. تم استخدام برنامج التحليل الزمني النانوي لملاءمة وتحديد قيم الديكورات الكويتية الظاهرة.
كانتثوابت التفكك الظاهرة 37.9 زائد أو ناقص 1.0 ميكرومولار للارتباط بزخارف الغاز ، و 23.3 زائد أو ناقص 0.6 ميكرومولار للارتباط بقليل النوكليوتيدات الغنية بالإضافة إلى 100. من المثير للدهشة أن s plus 100 تسلسل أظهر ارتباطا أكثر إحكاما قليلا من الغاز. في ثلاث تكرارات قياس ، أدى استبدال A إلى G إلى انخفاض كبير في تقارب s زائد 100 متحول.
في حين أن s زائد 100 متحولة اثنين لم تظهر أي ارتباط يمكن اكتشافه ، مما يؤكد الربط الانتقائي للتسلسل من STAT ثلاثة إلى s زائد 100 بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أقل من ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الظروف المثلى لاستخراج بروتينات الغشاء ستختلف باختلاف البروتينات وعادة ما تتطلب التحسين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد تقارب البروتين الأنيق دون تنقية البروتين من الخلية. المحلل.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول استخدام الثيرموفورة المصغرة (MST) لتحديد تقارب الارتباط بين تفاعلات البروتين والرابط مباشرة من المستخلصات الخلوية. يتضمن الأسلوب التعبير عن بروتين مرتبط بـ GFP، وإعداد المستخلصات الخلوية، وقياس إشارات MST بتركيزات مختلفة من الرابط.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- الكيمياء الحيوية
- تفاعلات البروتين والرابط
- تقنيات الثيرموفورة
الخلفية
- الثيرموفورة المصغرة هي أسلوب لقياس تقاربات الارتباط.
- تتيح التحليل دون الحاجة إلى تنقية البروتين.
- يسهل استخدام البروتينات المدمجة بـ GFP الكشف.
- توفر المستخلصات الخلوية سياقًا فسيولوجيًا أكثر للتفاعلات.
هدف الدراسة
- لتحديد تقاربات الارتباط بين تفاعلات البروتين والرابط.
- للاستفادة من المستخلصات الخلوية لإجراء قياسات أكثر دقة.
- لتبسيط العملية بتجنب تنقية البروتين.
الأساليب المستخدمة
- الإفراط في التعبير عن البروتينات المدمجة بـ GFP في خطوط الخلايا اللاصقة.
- إعداد المستخلصات الخلوية في ظروف غير مسببة للتفكك.
- إعداد تخفيفات الرابط لتحليل MST.
- قياس إشارات MST استجابةً لتركيزات مختلفة من الرابط.
النتائج الرئيسية
- تحديد ناجح لتقاربات الارتباط باستخدام MST.
- تدليل على قابلية الأسلوب للاستخدام مع روابط مختلفة.
- التحقق من النتائج من خلال تحليل البيانات لقياسات MST.
- إمكانية تطبيقات أوسع في دراسات تفاعلات البروتين.
الاستنتاجات
- MST هو أسلوب فعال لدراسة تفاعلات البروتين والرابط.
- يتيح البروتوكول التحليل مباشرة من المستخلصات الخلوية.
- يمكن لهذا الأسلوب تعزيز فهم التفاعلات البيوكيميائية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Determining binding affinity directly from cell lysates eliminates the bottleneck of protein purification, accelerating early-stage target validation and lead identification. This approach enables rapid assessment of protein-ligand interactions in a near-physiological context, improving predictive confidence for downstream screening campaigns. By reducing time and resource investment in protein production, the method supports higher-throughput screening of difficult targets such as transcription factors and membrane proteins.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring binding affinities of GFP-tagged proteins to oligonucleotides, peptides, or small molecules directly from lysates.
- Operational Value: Avoids protein purification steps, reducing timelines and costs associated with expressing and isolating difficult targets like STAT3.
- Predictive Value: Provides quantitative KD measurements that support target prioritization and go/no-go decisions in early discovery.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates reproducible, quantitative binding data from lysate-based systems suitable for hit confirmation and SAR exploration.
- Scalability: Compatible with serial ligand dilution formats and capillary-based MST platforms, enabling medium-throughput affinity profiling.
- Contextual Relevance: Maintains physiological buffer conditions and tolerates detergents, preserving native protein states for more translatable interaction data.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports mechanistic de-risking by validating target engagement in lysate systems that reflect cellular complexity.
- Biomarker Alignment: Enables assessment of how mutations or post-translational modifications affect binding, informing structure-function relationships relevant to disease variants.
- Risk-Adjusted Advancement: Affinity data from native-like environments improves confidence in selecting leads with favorable target interaction profiles.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, offering a lysate-compatible alternative to purified-protein assays for affinity measurement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying binding of GFP-fused transcription factors to DNA or protein ligands without purification.
- Screening: Enables assay readiness through standardized lysate preparation and ligand titration, yielding reproducible MST thermophoresis curves for affinity ranking.
- Analytics: Generates KD values with standard deviations from averaged MST thermophoresis traces, providing statistical outputs for comparing ligand potency and selectivity.
- Translational Research: Connects early binding data to preclinical relevance by using lysates from disease-relevant cell models (e.g., HEK293 expressing STAT3-GFP) to assess target behavior in near-native conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable lysate-based MST workflow applicable across multiple targets and ligand classes, reducing dependency on protein purification bottlenecks.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence through quantitative affinity measurements that reduce mechanistic ambiguity in target-ligand interactions.
- Operational Value: Increases standardization and reproducibility by eliminating variability introduced during protein purification and enabling direct comparison across lysate preparations.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by accelerating hit validation and reducing late-stage attrition due to poor target engagement predictions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on lysate-derived affinity data, supporting better resource allocation in early discovery portfolios.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescent protein tagging, cell culture, and lysate preparation under non-denaturing conditions.
- Dependent on access to an MST instrument with appropriate LED excitation (e.g., 470 nm for GFP) and capillary loading capabilities.
- Necessitates standardization of lysate dilution and ligand titration protocols to maintain fluorescence within the optimal 400–1500 unit range.
- Requires optimization for different protein classes (e.g., membrane proteins may need detergent-containing buffers) and ligand solubility considerations.
- Limited by the need for detectable fluorescence changes upon binding; may require validation for ligands that induce minimal thermophoresis shifts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:43
Preparation of Cell Lysate
4:02
Microscale Thermophoresis Binding Studies
7:05
Microscale Thermophoresis Data Analysis
8:25
Results: Measuring the Affinity of Non-phosphorylated STAT3 Protein Binding to Oligonucleotides
9:40
Conclusion
3:20
Determination of Optimal Lysate Dilution
