البروتين طريقة خالية من تنقية تجليد تحديد الانجذاب من قبل Thermophoresis الميكروسكيل

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد ألفة الارتباط بين البروتين والرابط دون الحاجة إلى تنقية البروتين من محلول التحلل الخلوي. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق التعبير عن البروتين المراد دراسته والمدمج مع GFP في أي خط خلايا ملتصق. وبعد تحضير محلول التحلل الخلوي وتخفيفات الرابط، يتم تحضير خلائط من محلول التحلل الخلوي والرابط ثم تحميلها في الشعيرات الدموية.

بعد ذلك، يتم قياس المقاومة الحرارية للبروتين المدمج مع GFP في ظل تركيزات متفاوتة من الربيطة. وتتمثل الخطوة النهائية في تحليل بيانات قياسات الترحيل الحراري مجهري النطاق أو MST. وفي النهاية، يُستخدم الترحيل الحراري مجهري النطاق لتحديد ألفة الارتباط للتفاعلات بين البروتينات المدمجة مع GFP والربيطات المختلفة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل المعايرة، أو قياس السعرات الحرارية، أو رنين البلازمون السطحي، في أنها تتجنب عملية تنقية البروتين، مما يبسط ويسرع بشكل كبير التوصيف الكمي للتفاعلات الثنائية. وتقدم هذه الطريقة مزايا كبيرة عند العمل مع البروتينات التي يصعب التعبير عنها وتنقيتها، مثل بروتينات الغشاء وعوامل النسخ. ومن أكبر مزايا تقنية الترحيل الحراري ميكروي المقياس (microscale thermophoresis) أنها تعمل في مجموعة متنوعة من المحاليل المنظمة وتتحمل وجود المنظفات والخلايا في النظام. ستقوم كارين ستيفكا، وهي عالمة أحياء من مختبري، بشرح هذه التقنية. للبدء، اغسل الخلايا لفترة وجيزة بمحلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) بارد جداً، باستخدام 10 milliliters من المحلول المنظم لكل دورق T 75.

احتفظ بالخلايا على الثلج لمدة خمس دقائق أو حتى تبدأ في الانفصال عن الدورق. استخدم كاشطة الخلايا لكشط الخلايا وفصلها إذا لزم الأمر. أعد تعليق الخلايا في 10 milliliters من محلول PBS المبرد بالثلج وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي بقاع مستدير سعة 14 milliliter مبرد مسبقاً.

قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة 400 إلى 600 Gs ودرجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 200 µL من محلول التحلل (lysis buffer) المبرد بالثلج. انقل المعلق إلى أنبوب إيبندورف سعة 1.5 mL مبرد مسبقاً لاستخلاص البروتينات السيتوسولية.

ضع الخلايا على الثلج لتقليل ارتفاع درجة الحرارة الموضعي، ثم قم بتحليل الخلايا باستخدام ثلاث نبضات من الموجات فوق الصوتية مدة كل منها عشر ثوانٍ وبسعة 30%. وباستخدام رأس مسبار مبرد مسبقاً يتراوح قطره بين 2 إلى 3 ملم، حافظ على بقاء الرأس تحت السطح لتقليل تكوّن الرغوة. يتم تخطي هذه الخطوة عند استخدام محلول منظم يحتوي على منظف، ثم تُحضن العينات على الثلج لمدة 30 دقيقة.

بدلاً من ذلك، قم بتعديل محلول المستخلص ليحتوي على تركيز ملحي فسيولوجي يبلغ 100 millimolar من كلوريد الصوديوم إذا لزم الأمر، وذلك باستخدام محلول مخزون بتركيز خمس molar من كلوريد الصوديوم. وأخيراً، اجمع المستخلصات عن طريق الطرد المركزي عند حوالي 25, 000 Gs ودرجة حرارة أربع degrees Celsius لمدة 10 دقائق. اختر مصدر إثارة الصمام الثنائي الباعث للضوء أو LED بطول موجي يساوي 470 nanometers في جهاز MST.

قم بتحميل الأنابيب الشعرية بمستخلص خلوي مخفف بمقدار مرتين و10 مرات باستخدام منظم MST، ثم ضعها في جهاز MST. قم بتنفيذ عملية البحث عن الأنابيب الشعرية (find capillaries) عبر البرنامج التشغيلي لجهاز MST. يتراوح نطاق الفلورة الأمثل في المستخلص المخفف من 400 إلى 1500 وحدة فلورة.

باشر بتحديد نطاق تركيز الربيطة الأمثل كما هو موضح في البروتوكول النصي. ضع حامل أنابيب يحتوي على العدد اللازم من أنابيب الطرد المركزي ذات الارتباط المنخفض سعة 0.5 milliliter على الثلج، ثم انقل بواسطة الماصة 25 microliters من منظم MST إلى قاع كل أنبوب، وأضف 25 microliters من المحلول المخزون للربيطة إلى الأنبوب الأول، وأجرِ تخفيفاً تسلسلياً بمقدار ضعفين للربيطة باستخدام بقية الأنابيب. احتفظ بحامل عينات الربيطة على الثلج.

احسب تخفيف مستخلص الخلايا للوصول إلى المستوى الأمثل من البروتين المستهدف الفلوري في تفاعلات الارتباط. يجب أن يكون تركيز البروتين النهائي قريباً من ثابت تفكك الارتباط المتوقع أو أقل منه، وينبغي ضبطه للحصول على عدد عدات الفلورة اللازمة. في المحلول النهائي، ابدأ بتخفيف مستخلص الخلايا باستخدام MST Buffer.

ضع أنابيب ذات ارتباط منخفض سعة 0.5 milliliter في حامل الأنابيب مقابل الأنابيب التي تحتوي على عينات التخفيف المتسلسل للربيطة. أضف بعناية 15 microliters من محلول تحلل الخلايا إلى قاع كل أنبوب. تجنب ملامسة جدران الأنابيب لتفادي فقدان العينة.

أضف 15 µL من عينة الربيطة ذات التركيز الأعلى إلى الأنبوب المقابل. الرقم واحد، مع مستخلص الخلايا. اخلط جيداً وقم بتغيير رأس الماصة.

كرر هذه الخطوة مع بقية الأنابيب باستثناء الأنبوب الأخير، والذي يجب ألا يحتوي على أي ربيطة. أضف 15 µL من منظم MST إلى الأنبوب الأخير واخلطه. املأ حوالي ثلثي الشعيرة الأولى بمزيج الارتباط من الأنبوب رقم واحد.

أمل الأنبوب لتحريك المحلول نحو المركز، ثم ضع الأنبوب الشعري في الموضع رقم واحد على صينية الأنابيب الشعرية. كرر هذه الخطوة مع بقية الأنابيب الشعرية. يمكن سد أطراف الأنابيب الشعرية بالشمع في التجارب التي تستغرق وقتاً أطول.

ضع الصينية داخل جهاز MST وأغلق باب الجهاز. بعد ذلك، اختر مصدر إثارة LED بطول موجي يساوي 470 nanometers. في جهاز MST، قم بتنفيذ أمر البحث عن الشعيرات (find capillaries) للسماح للجهاز بتحديد المواقع الدقيقة للشعيرات وقياس الفلورة للعينات بناءً على كثافة إشارة الفلورة.

اضبط قدرة الـ LED لتكون ضمن النطاق من 400 إلى 1500 وحدة. انقر على زر البدء لإجراء تجربة المقاومة الحرارية (Thermo Resis Experiment). يمكن اختيار أكثر من قيمة لقدرة ليزر الأشعة تحت الحمراء في التجربة.

من أجل إيجاد تدرج درجة الحرارة الأمثل لهذا النظام تحديداً، يستغرق تشغيل مجموعة واحدة مكونة من 16 شعيراً دقيقاً ما بين 10 إلى 12 دقيقة. قم بجمع البيانات من تشغيلين إلى ثلاثة تشغيلات لنفس مجموعة الشعيرات لضمان تكرارية القياسات. لبدء تحليل البيانات، افتح برنامج التحليل وقم بتحميل مجلد المشروع.

في عارض تشغيل المعلومات الظاهرة، اختر منحنيات الثيرموريتيك التي تم جمعها عند قدرة ليزر IR محددة. كان هناك خيار لفتح جميع آثار الثيرموريتيك التي تم جمعها تحت ظروف متنوعة في آن واحد، ثم اختيار أي منحنيات للتحليل عن طريق تشغيلها أو إيقاف تشغيلها. في نافذة رسم نقاط التقييم، اختر المقاومة الحرارية (thermo resis) أو الترحيل الحراري (thermo pheresis) مع الخطوط الزرقاء والحمراء الخاصة بـ T jump.

حدد منطقتين من المنحنيات التجريبية التي يتم اختيارها يدويًا للتحليل بواسطة البرنامج. تأكد من وضع الخطوط الزرقاء والحمراء بشكل صحيح لضمان الحصول على أقصى تغيير في Thermo Resis. وللحصول على النقاط المتوسطة مع الانحرافات المعيارية، اختر use average أو distinguish runs للتجارب المنفصلة.

لرسم ملاءمة ثابت التفكك، حدد خيار "use average"، ثم أدخل قيمة تركيز الجزيء المسمى وثبتها وقم بملاءمة المنحنى. ستظهر قيمة ثابت تفكك الارتباط أو قيمة KD مع الانحراف المعياري الخاص بها في نافذة معلومات منبثقة منفصلة. احفظ بيانات الملاءمة المتوسطة في ملف نصي وانقلها إلى برنامج Excel.Heck.

استُخدمت خلايا 2 9 3 التي تعبر عن STAT 3G FP كمصدر لبروتين stat three المسمى فلوروسنتياً. بالنسبة لمقايسة الارتباط بالحمض النووي DNA، أدى ارتباط قليلات النوكليوتيد عالية الشحنة إلى تغييرات ملحوظة في حركية STAT three. في التدرج الحراري.

يتم رسم إشارة Thermo retic كدالة في تركيز oligonucleotides. تمثل كل نقطة بيانات متوسط ثلاث قياسات. تم استخدام برنامج Nano temporal analysis لملاءمة البيانات وتحديد قيم KD الظاهرية.

كانت ثوابت التفكك الظاهرية 37.9 ± 1.0 ميكرومولار للارتباط بنمط gas، و23.3 ± 0.6 ميكرومولار للارتباط بـ oligonucleotide الغني بـ at والمسمى s plus 100. ومن المثير للدهشة أن تسلسلات s plus 100 أظهرت ارتباطاً أقوى قليلاً من gas. وفي ثلاث تكرارات للقياس، أدى استبدال A بـ G إلى انخفاض حاد في ألفة الطفرة الأولى لـ s plus 100.

بينما لم يُظهر الطافر s plus 100 mutant two أي ارتباط يمكن اكتشافه، مما يؤكد الارتباط الانتقائي لتسلسل STAT three بـ s plus 100. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في أقل من ساعتين إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر أن الظروف المثالية لاستخلاص بروتينات الغشاء ستختلف باختلاف البروتينات وعادةً ما تتطلب تحسيناً. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد ألفة ارتباط بروتين بـ elegant دون تنقية البروتين من مستخلص الخلية (cell lysate).