CometChip: إنتاجية عالية منصة 96-حسنا لقياس الحمض النووي من التلف في خلايا الإنسان Microarrayed

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية استخدام شريحة COMET لإجراء قياسات تلف الحمض النووي عالية الإنتاجية في خلايا الثدييات. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحميل خلايا الثدييات أولا في شريحة المذنب. الخطوة الثانية هي معالجة الخلايا بمواد كيميائية معروفة بأنها تسبب تلفا في الحمض النووي.

بعد ذلك ، يتم تحلل الخلايا و Electro East باستخدام بروتوكولات فحص COMET التقليدية. الخطوة الأخيرة هي التصوير الفلوري للحمض النووي الخلوي لتصور هجرة الحمض النووي التالف. في النهاية ، يتم استخدام برنامج تحليل الصور لتحديد مدى تلف الحمض النووي.

لذا فإن مقايسة com كانت موجودة منذ فترة طويلة حقا وهي اختبار مفيد للغاية للنظر في الكثير من الأنواع المختلفة من تلف الحمض النووي. لكن المشكلة كانت أنها إنتاجية منخفضة حقا وتفتقر إلى الحساسية. لذلك أنشأنا شريحة COMET ، والتي هي في الأساس نسخة عالية الإنتاجية من اختبار COMET الذي يجعل من الممكن إجراء فحص عالي الإنتاجية لفحص الأدوية ، على سبيل المثال ، وللدراسات الوبائية.

سيقوم طالب الدراسات العليا في Jing GA في مختبري بعرض الإجراء. رقاقة الغيبوبة عبارة عن مادة هلامية تحتوي على مجموعة من الآبار الصغيرة المنتجة من ختم صغير المصنع مع أعمدة صغيرة بأقطار صغيرة مثل تلك الموجودة في خلية واحدة لتبدأ في وضع فيلم رابطة هلامية مستطيل بئر واحد لأسفل. بعد غسل الجل مرتين في 25 مل في XPBS واحد ، ضع شريحة الفاصلة على لوح زجاجي ، ثم قم بتسمية اتجاه الجل وفقا لذلك.

الآن اضغط برفق على صفيحة بئر 96 مقلوبة بلا قاع في الجل للتأكد من أن جميع الآبار البالغ عددها 96 بئر داخل منطقة الجل. ثم قم بقص جانبي لوحة البئر 96 على اللوح الزجاجي بمشابك رابطة مقاس 1.5 بوصة. أخيرا ، استنشق أي PBS زائد من كل منها.

حصاد الخلايا المعلقة أو الملتصقة جيدا وفقا للإجراءات القياسية وتخفيف الخلايا بالوسائط إلى تركيز نهائي من 100 ، 000 إلى 1 مليون خلية لكل مليلتر. تأكد من الحصول على تعليق خلية واحدة عن طريق المرور عبر مرشح الخلية إذا لزم الأمر. ماصة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر ، رقاقة المذنب 96 لوحة بئر عند الانتهاء.

قم بتغطية اللوحة بغشاء رابطة الهلام لمنع التبخر ، ثم ضعه في حاضنة مثبتة على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة بعد إخراج اللوحة من الحاضنة. عند انقضاء 30 دقيقة ، استنشق الوسائط من كل منها ، ثم قم بإزالة مشابك الموثق ولوحة 96 Well التي لا نهاية لها أمسك شريحة المذنب باللوحة الزجاجية بزاوية واشطفها برفق باستخدام XPBS واحد لإزالة أي خلايا زائدة أعلى العروض. الآن شاهد اللوحة من خلال عدسة موضوعية بأربعة x على مجهر مجال ساطع للتحقق من التحميل الأمثل للخلية بعد تحميل خلايا كافية ، ضع شريحة com على سطح مستو ، تراكب مع 1٪ نقطة انصهار منخفضة تم تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية.

اترك التراكب يتجمد في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق ثم ضعه أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق حتى يتسم التاريخ الكامل لجرعة الخلايا بالمواد الكيميائية ذات الأهمية. أولا ، قم بمحاذاة آبار رقاقة المذنب بعناية مع آبار لوحة بئر 96 جديدة بلا قاع واضغط لأسفل. قم بتثبيت لوحة البئر 96 على اللوحة الزجاجية بمشابك رابطة كما كان من قبل.

ثم ضع اللوحة على الثلج وأضف 100 ميكرولتر من المادة الكيميائية ذات الأهمية بالجرعة المطلوبة لكل بئر اسمح للمادة الكيميائية قيد الفحص بالبقاء على الخلايا مع الفترة الزمنية المطلوبة بعد الجرعات ، وشفط المحلول الكيميائي من كل بئر واشطفه ب XPBS واحد إذا لزم الأمر. قطع الجل إلى قطع منفصلة. ثم لدراسة حركية الإصلاح ، أضف وسائط الثقافة إلى احتضان الآبار والمضي قدما في تحلل الخلايا في نقاط زمنية محددة إلى خلايا LY لمقايسة المذنب القلوي.

قم بإعداد ما يقرب من 25 مل من محلول التحلل القلوي العامل لكل شريحة عن طريق إضافة 1٪ Triton X 100 إلى محلول مخزون التحلل القلوي. ثم يبرد مسبقا عند أربع درجات مئوية. صب المخزن المؤقت للتحلل القلوي في حاوية أكبر بقليل من شريحة المذنب.

ثم اغمر الرقاقة القلوية في مكان التحلل القلوي المبرد في الثلاجة واترك التحلل يستمر طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بإزالة شريحة المذنب من المخزن المؤقت للتحلل وسرعان ما باستخدام XPBS واحد. ثم ضع الشريحة في حجرة الرحلان الكهربائي بحيث يكون جانب فيلم الجل متجها لأسفل وتثبيته بشريط لاصق على الوجهين.

خذ الغرفة إلى الغرفة الباردة بأربع درجات مئوية واملأ الغرفة بمخزن الرحلان الكهربائي القلوي البارد إلى مستوى يغطي الجل فقط. ثم اترك الشريحة عند أربع درجات مئوية لمدة 40 دقيقة للسماح بالفك القلوي. أخيرا ، قم بتشغيل الجل بفولت واحد لكل سنتيمتر و 300 مللي أمبير لمدة 30 دقيقة.

في الغرفة الباردة ، اضبط حجم المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي في الغرفة لتحقيق تيار التشغيل المطلوب. بالنسبة لمقايسة المذنب المحايد ، اجعل المخزن المؤقت للتحلل المحايد يعمل عن طريق إضافة 1٪ Triton X 110٪ DMSO إلى محلول مخزون التحلل المحايد. مرة أخرى ، تحضير ما يقرب من 25 مل من مخزن تحلل العمل لكل شريحة.

ضع المخزن المؤقت للتحلل المحايد العامل في الحاضنة المضبوطة على 43 درجة مئوية للتدفئة المسبقة. بعد تسخين المخزن المؤقت للتحلل المحايد ، اغمر شريحة الفاصلة في المخزن المؤقت للتحلل المحايد وضعها في حاضنة 40 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بإزالة المخزن المؤقت للتحلل المحايد ثم قم بإزالة المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي المحايد لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية في كل مرة ، قم بتأمين الشريحة في غرفة الرحلان الكهربائي ونقلها إلى الغرفة الباردة.

كما كان من قبل ، املأ غرفة الرحلان الكهربائي بمخزن حراري بارد محايد إلى مستوى يغطي الجل فقط ويسمح للهلام بالجلوس في غرفة باردة لمدة 60 دقيقة ، وقم بتشغيل الجل بقوة 0.6 فولت لكل سنتيمتر وستة مللي أمبير لمدة 60 دقيقة في الغرفة الباردة. مرة أخرى ، اضبط حجم المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي في الغرفة لتحقيق تيار التشغيل المطلوب إذا لزم الأمر. بعد إزالة شريحة com من الغرفة الباردة ، قم بتحييد المواد الهلامية عن طريق الغسيل والتحييد المخزن المؤقت مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما عند أربع درجات مئوية.

ابق في الرقاقة مع صبغة الحمض النووي الفلورية مثل الذهب السائبرجي أو بروميد الإيريديوم. وفقا لتعليمات الشركة المصنعة والصورة باستخدام ممثل المجهر الفلوري ، تظهر مذنبات Microwell من المعارف التقليدية غير المعالجة ستة خلايا ليمفاوية في اللوحة العلوية من هذا الرسم التخطيطي. تعرضت الخلايا الست من المعارف التقليدية ل 50 بيروكسيد هيدروجين ميكرومولار في اللوحة الوسطى و 100 بيروكسيد هيدروجين ميكرومولار في اللوحة السفلية.

كانت جميع حالات التعرض لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. يوضح هذا الرسم البياني الخطي استجابة جرعة بيروكسيد الهيدروجين لست خلايا من المعارف التقليدية. كل نقطة بيانات هي متوسط ثلاث تجارب مستقلة حيث تم الحصول على متوسط النسبة المئوية للحمض النووي للذيل لما لا يقل عن 50 مذنبا فرديا في كل تجربة.

يوضح هذا الرسم البياني تباين عينة إلى عينة لمقايسة رقاقة الفاصلة للمعارف التقليدية ست خلايا مكشوفة نسبة بيروكسيد الهيدروجين المكشوفة بيانات الحمض النووي لكل بئر موضحة هنا. يمثل كل صندوق متوسط ما لا يقل عن 50 مذنبا فرديا من كل بئر. متوسط 12 بئرا 77 نقطة 53٪ الانحراف المعياري 3.99٪ ومعامل التباين 5.2٪ يوضح هذا الرسم البياني التباين من تجربة إلى تجربة.

تكرر نفس التعرض لبيروكسيد الهيدروجين ست مرات ، وتظهر بيانات كل تكرار كشريط رمادي. يمثل كل صندوق متوسط النسبة المئوية للحمض النووي للذيل لما لا يقل عن 100 مذنب فردي من كل تكرار. متوسط ستة تكرارات هو 49.57٪ كما هو موضح كشريط خلفي هنا.

الانحراف المعياري لستة تكرارات هو 4.99٪ وشريط الخطأ في المتوسط هو 2.04٪ ممثلة على أنها شريط الهواء في الشكل مثل المقايسة الشائعة التقليدية. الباحثون أحرار في إجراء تعديلات على هذا الإجراء أو استخدام فوضى أخرى ، مثل تضمين إنزيمات محددة للآفة المنقاة للإجابة على أسئلة إضافية حول نوع تلف الحمض النووي الناتج في الخلايا. مهدت تقنية رقاقة المذنب الطريق لدراسات خلايا الثدييات للتعرف على تلف الحمض النووي وإصلاحه.

ونظرا لأنه عالي الإنتاجية ، فإنه يجعل من الممكن إجراء دراسات سريرية ووبائية لم تكن ممكنة من قبل بسبب عدد العينات.