CometChip: إنتاجية عالية منصة 96-حسنا لقياس الحمض النووي من التلف في خلايا الإنسان Microarrayed

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية استخدام شريحة COMET لإجراء قياسات عالية الإنتاجية لتلف الحمض النووي DNA في الخلايا الثديية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحميل الخلايا الثديية في شريحة COMET، ثم تتمثل الخطوة الثانية في معالجة الخلايا بمواد كيميائية معروفة بتسببها في تلف DNA.

بعد ذلك، يتم تحلل الخلايا واستخلاصها باستخدام بروتوكولات مقايسة COMET التقليدية. وتتمثل الخطوة النهائية في التصوير الفلوري للحمض النووي الخلوي لتصور هجرة الحمض النووي التالف. وفي النهاية، يتم استخدام برنامج لتحليل الصور لقياس مدى تلف الحمض النووي.

لقد كان مقايسة المذنب (comet assay) مستخدماً لفترة طويلة جداً، وهو مقايسة مفيدة للغاية لفحص أنواع مختلفة من تلف DNA. ولكن المشكلة تكمن في أن إنتاجيته منخفضة جداً ويفتقر إلى الحساسية. لذا قمنا بابتكار شريحة COMET، وهي أساساً نسخة عالية الإنتاجية من مقايسة المذنب، مما يجعل من الممكن إجراء فحص عالي الإنتاجية لفحص الأدوية، على سبيل المثال، وللدراسات الوبائية.

سيقوم الطالب في مرحلة الدراسات العليا Jing GA من مختبري بشرح الإجراء. شريحة coma هي عبارة عن هلام يحتوي على مصفوفة من الآبار الدقيقة التي تم إنتاجها بواسطة ختم مصنع دقيق يحتوي على أعمدة دقيقة بأقطار صغيرة تصل إلى حجم خلية واحدة، وللبدء يتم وضعها في لوحة مستطيلة ذات بئر واحد بحيث يكون جانب غشاء ربط الهلام متجهًا للأسفل. بعد غسل الهلام مرتين في 25 milliliters من XPBS، ضع شريحة coma على لوحة زجاجية، ثم حدد اتجاه الهلام وفقًا لذلك.

الآن، اضغط بلطف بصفيحة 96 بئراً مقلوبة وبدون قاع فوق الجل، مع التأكد من أن جميع الآبار الـ 96 تقع ضمن منطقة الجل. بعد ذلك، قم بتثبيت كلا جانبي صفيحة 96 بئراً بالصفيحة الزجاجية باستخدام مشابك أوراق مقاس 1.5 بوصة. وأخيراً، قم بشفط أي فائض من محلول PBS من كل منهما.

قم بحصاد الخلايا العالقة أو الملتصقة وفقاً للإجراءات القياسية، ثم خفف الخلايا بالوسط الغذائي للوصول إلى تركيز نهائي يتراوح بين 100,000 إلى 1 مليون خلية لكل ملليلتر. تأكد من الحصول على معلق خلوي أحادي من خلال التمرير عبر مرشح خلايا إذا لزم الأمر. انقل 100 µL من معلق الخلايا إلى كل بئر في لوحة comet chip ذات 96 بئراً بعد الانتهاء.

غطِّ الطبق بفيلم ربط الهلام (gel bond film) لمنع التبخر، ثم ضعه في حاضنة مضبوطة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة بعد إخراج الطبق من الحاضنة. عند انقضاء الـ 30 دقيقة، اشفط الوسط من كل بئر، ثم قم بإزالة مشابك التثبيت وطبق الـ 96 بئراً عديم القاع. أمسك بشريحة المذنب (comet chip) مع اللوح الزجاجي بزاوية وقم بشطفها برفق باستخدام 1X PBS لإزالة أي خلايا زائدة فوق الأغاروز. الآن، افحص الطبق باستخدام عدسة شيئية 4x على مجهر الحقل المضيء للتحقق من التحميل الأمثل للخلايا. بعد تحميل عدد كافٍ من الخلايا، ضع شريحة المذنب على سطح مستوٍ، وقم بتغطيتها بطبقة من الأغاروز بنسبة 1% منخفض درجة الانصهار والذي تم تدفئته مسبقاً إلى 37 درجة مئوية.

اترك الطبقة الفوقية لتتصلب في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق، ثم ضعها في درجة حرارة 4 °C لمدة خمس دقائق لضمان التثبيت الكامل قبل تعريض الخلايا للمواد الكيميائية المراد دراستها. أولاً، قم بمحاذاة آبار شريحة المذنب (comet chip) بعناية مع آبار لوحة 96 بئر جديدة بدون قاع واضغط لأسفل. قم بتثبيت لوحة 96 بئر بالشريحة الزجاجية باستخدام مشابك الورق كما سبق.

بعد ذلك، ضع الطبق على الثلج وأضف 100 µL من المادة الكيميائية المراد دراستها بالجرعة المطلوبة إلى كل بئر. اترك المادة الكيميائية قيد البحث على الخلايا للفترة الزمنية المطلوبة بعد الجرعة، ثم اشفط المحلول الكيميائي من كل بئر واشطف بـ XPBS واحد إذا لزم الأمر. قطع الهلام إلى قطع منفصلة. ثم لدراسة حركية الإصلاح، أضف أوساط الزرع إلى الآبار واحضنها، ثم انتقل إلى تحلل الخلايا في نقاط زمنية محددة لتحليل الخلايا (LY) من أجل اختبار المذنب القلوي.

قم بتحضير 25 ملليلتر تقريباً من محلول التحلل القلوي العامل لكل شريحة عن طريق إضافة 1%Triton X 100 إلى المحلول المخزون من سائل التحلل القلوي. ثم يتم تبريده مسبقاً عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. صب محلول التحلل القلوي في وعاء أكبر قليلاً من شريحة المذنب (comet chip).

بعد ذلك، اغمر الشريحة القلوية في محلول التحلل القلوي العامل المبرد الموجود في الثلاجة، واترك عملية التحلل تستمر طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. وفي اليوم التالي، أخرج شريحة المذنبة (comet chip) من محلول التحلل واشطفها بسرعة باستخدام XPBS واحد. ثم ضع الشريحة في غرفة الرحلان الكهربائي بحيث يكون جانب غشاء الهلام متجهًا لأسفل، وثبتها باستخدام شريط لاصق مزدوج الوجه.

انقل الحجرة إلى غرفة التبريد عند درجة حرارة 4 °C واملأ الحجرة بمحلول منظم للفصل الكهربائي القلوي البارد حتى يصل المستوى إلى ما يغطي الهلام تماماً. بعد ذلك، اترك الشريحة عند درجة حرارة 4 °C لمدة 40 دقيقة للسماح بفك الالتفاف القلوي. وأخيراً، قم بتشغيل الهلام بجهد 1 volts per centimeter وتيار 300 milliamps لمدة 30 دقيقة.

في الغرفة الباردة، اضبط حجم منظم الفصل الكهربائي في الغرفة لتحقيق تيار التشغيل المطلوب. بالنسبة لمقايسة المذنبات المتعادلة، قم بتحضير محلول تحليل متعادل عامل عن طريق إضافة 1%Triton X 110%DMSO إلى محلول تحليل متعادل مركز. ومرة أخرى، يتم تحضير 25 milliliters تقريباً من محلول التحليل العامل لكل شريحة.

ضع محلول التحلل المتعادل المستخدم في الحاضنة المضبوطة على 43 درجة Celsius للتدفئة المسبقة. بعد تدفئة محلول التحلل المتعادل، اغمر شريحة الفاصلة (comma chip) في محلول التحلل المتعادل وضعها في حاضنة عند 40 درجة Celsius طوال الليل. في اليوم التالي، أزل محلول التحلل المتعادل ثم اشطفها مرتين بمحلول الفصل الكهربائي المتعادل لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات Celsius. وفي كل مرة، ثبت الشريحة في غرفة الفصل الكهربائي وانقلها إلى الغرفة الباردة.

كما في السابق، املأ حجرة الفصل الكهربائي بمحلول منظم للفصل الكهربائي متعادل وبارد حتى مستوى يغطي الهلام بالكاد، واترك الهلام في غرفة باردة لمدة 60 دقيقة، ثم قم بتشغيل الهلام عند 0.6 فولت لكل سنتيمتر وستة مللي أمبير لمدة 60 دقيقة في الغرفة الباردة. ومرة أخرى، اضبط حجم محلول منظم الفصل الكهربائي في الحجرة لتحقيق تيار التشغيل المطلوب إذا لزم الأمر. بعد إخراج شريحة الـ com من الغرفة الباردة، قم بمعادلة الهلامات عن طريق الغسل بمحلول منظم للمعادلة مرتين لمدة 15 دقيقة لكل مرة عند درجة حرارة 4 °C.

قم بتثبيت العينات داخل الشريحة باستخدام صبغة DNA فلورية مثل cyberg gold أو iridium bromide، وذلك وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. يوضح اللوح العلوي من هذا المخطط صوراً مجهرية فلورية تمثيلية لمذنبات الآبار الدقيقة (Microwell comets) من خلايا TK six اللمفاوية غير المعالجة. بينما يوضح اللوح الأوسط الخلايا من نوع TK six التي تعرضت لـ 50 micromolar من بيروكسيد الهيدروجين، واللوح السفلي الخلايا التي تعرضت لـ 100 micromolar من بيروكسيد الهيدروجين.

كانت جميع فترات التعرض لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. يوضح هذا الرسم البياني الخطي استجابة خلايا TK six لجرعات بيروكسيد الهيدروجين. تمثل كل نقطة بيانات متوسط ثلاث تجارب مستقلة، حيث تم الحصول على متوسط النسبة المئوية للحمض النووي في ذيل ما لا يقل عن 50 مذنباً فردياً في كل تجربة.

يوضح هذا الرسم البياني التباين بين العينات في مقايسة شريحة الكوما لخلايا TK6 المعرضة لبيروكسيد الهيدروجين، حيث تظهر هنا بيانات النسبة المئوية للحمض النووي في الذيل لكل بئر. يمثل كل صندوق القيمة الوسيطة لـ 50 مذنباً فردياً على الأقل من كل بئر. ويبلغ متوسط 12 بئراً 77.53%، بينما ينحرف الانحراف المعياري بمقدار 3.99%، ومعامل التباين هو 5.2%. كما يوضح هذا الرسم البياني التباين من تجربة إلى أخرى.

تم تكرار التعرض نفسه لبيروكسيد الهيدروجين ست مرات، وتظهر بيانات كل تكرار كشريط رمادي. يمثل كل مربع النسبة المئوية الوسيطة للحمض النووي في الذيل لما لا يقل عن 100 مذنب فردي من كل تكرار. يبلغ متوسط التكرارات الستة 49.57%، وهو موضح هنا كشريط خلفي.

يبلغ الانحراف المعياري لست مكررات 4.99% وشريط الخطأ للمتوسط هو 2.04% متمثلاً في شريط الخطأ في الشكل، تماماً كما في المقايسة الشائعة التقليدية. وللباحثين الحرية في إجراء تعديلات على هذا الإجراء أو استخدام طرق أخرى، مثل إضافة إنزيمات منقاة متخصصة في الآفات للإجابة على أسئلة إضافية حول نوع تلف DNA الناتج في الخلايا. وقد مهدت تقنية شريحة المذنّب الطريق لدراسات الخلايا الثديية للتعرف على تلف DNA وإصلاحه.

ونظراً لكونه ذا إنتاجية عالية، فإنه يتيح إمكانية إجراء دراسات سريرية ووبائية لم تكن ممكنة من قبل بسبب عدد العينات.