تحديد مجموعات الخلايا العصبية الحسية المحددة لدراسة القنوات الأيونية المعبر عنها

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الخلايا العصبية الواردة عن طريق وضع العلامات على الصبغة إلى الوراء ودراسة القنوات الأيونية في هذه الخلايا العصبية باستخدام الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح والكيمياء المناعية. يتم تحقيق ذلك عن طريق حقن DAI أولا في الأنسجة المستهدفة لتسمية الخلايا العصبية الواردة المؤشرة. الخطوة الثانية هي عزل الخلايا العصبية الواردة من العقد الجذرية الظهرية.

بعد ذلك ، يتم تثبيت الخلايا العصبية المسماة لتسجيل القنوات الأيونية المسورة ، والخطوة الأخيرة هي تحديد القنوات الأيونية المعبر عنها في الخلايا العصبية المسماة باستخدام الكيمياء المناعية. في النهاية باستخدام مزيج من الرقعة والمشبك والكيمياء المناعية ، يمكننا تحديد نمط التعبير بالإضافة إلى الخصائص الوظيفية للقنوات الأيونية في الخلايا العصبية الواردة. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة على الطريقة الأخرى الموجودة هي أنها طريقة غير جراحية و DAI الذي نستخدمه ، يعرف DAI I بامتصاصه السريع من قبل المحطات العصبية.

عدم وجود نقل بين الخلايا العصبية والاحتفاظ على المدى الطويل داخل الخلايا العصبية التي نحقنها. سأعرض الإجراء أنا وستيفاني ، فني أبحاث من مختبرنا لحقن الصبغة. أولا ، احلق الشعر فوق منطقة ربلة الساق على كلا ساقي الجرذ المخدر باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية.

بعد ذلك ، املأ حقنة معقمة CC واحدة ب 200 ميكرولتر من محلول Dai بنسبة 1.5٪. أدخل الإبرة ببطء بالتوازي مع المحور الطويل لكل عضلة معدية وحقن 100 ميكرولتر من داي في العضلة قبل سحب الإبرة من العضلات. اسحب مكبس المحقنة للخلف للتأكد من أن الصبغة لم تعد تتدفق من الحافة.

انتظر 10 ثوان ثم اسحب الإبرة من العضلات. هناك حاجة إلى أربعة إلى خمسة أيام لتوزيع الصبغة لإعداد التشريح. ضع دقابا به 10 ملليلتر من HBSS وطبق بتري 35 ملم وطبق بتري 100 ملم على الثلج.

بعد ذلك ، قم بوزن سبعة ملليغرامات من الكولاجيناز ، ومليغرام واحد من الحمض النووي و 10 ملليغرام من التربسين ، وحمام مائي يهتز إلى 37 درجة مئوية وقم بتسخين أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من EBSS في الحمام. بعد القتل الرحيم للفأر قبل التشريح ، افتح الجلد بسرعة على ظهر. ثم قم بإزالة النسيج الضام والعضلي على طول العمود الفقري للتعرض بشكل أفضل.

بعد ذلك ، قم بإزالة الجزء القطني من العمود الفقري. بعد ذلك ، ضع العمود الفقري المعزول في طبق بتري 100 ملم. ضع محلول HBSS المبرد باستخدام ماصة مراعي معقمة للحفاظ على المستحضر رطبا وباردا.

قطع العضلات من جانبي العمود الفقري. قم بإجراء استئصال الصفيحة الفقرية الظهرية باستخدام المقص أو المقص لإزالة العظام برفق وإغلاق التجاويف التي تحتوي على عقد الجذر الظهري. مرارا. ضع HBSS المثلج البارد أثناء هذا الإجراء.

تحت المجهر ، اعزل DRG عن طريق قطع الأعصاب الطرفية والمركزية ، مع ترك واحد إلى ملليمترين من العصب لتسهيل التعامل مع العقد. ثم ضع DRG المعزول في طبق بتري مقاس 35 ملم الذي يحتوي على عازلة HBSS المثلجة. كرر الإجراءات حتى يتم عزل جميع L four و L five DRG.

قم بإزالة الأعصاب والأوعية الدموية الزائدة باستخدام مقص دقيق وملقط. اقطع DRG للتعرض بشكل أفضل للإنزيمات ، ولكن لا تقم بتغليف DRG لتفكك الخلايا العصبية DRG. أضف الإنزيمات إلى وسط EBSS الدافئ ، ثم قم بدوامة لإذابة وتعقيم التصفية.

بعد ذلك ، ضع كل DRG في محلول الإنزيم برأس أنبوب مراعي معقم. بعد ذلك ، قم بفقاعة القارورة بنسبة 95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 60 ثانية قبل تغطية القارورة بإحكام. ثم احتضان القارورة في حمام مائي يهتز 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة عند 240 دورة في الدقيقة.

في نهاية الحضانة بقوة. رج القارورة 50 مرة لفصل DRG في ظروف معقمة. أضف خمسة ملليلتر من MEM plus إلى القارورة لإيقاف الأنشطة الأنزيمية.

انقل محتويات القارورة إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل ، وجهاز طرد مركزي بمعدل 16 مرة G لمدة ست دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها. أضف خمسة ملليلتر من MEM plus إلى العينة بلطف باستخدام الماصة.

لتفتيت الحبيبات ، كرر خطوة الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها وإضافة 500 ميكرولتر من MEM بالإضافة إلى الخزف برفق باستخدام طرف الماصة المليلتر الواحد على الماصة لعمل تعليق خلوي. بعد ذلك ، ضع غطاء زجاجي مطلي بالبولي ليسين في طبق فارغ ومعقم 35 ملم. ثم أضف قطرة من تعليق الخلية إلى وسط زلة الغطاء.

كرر هذا الإجراء حتى يتم استنفاد محلول الخلية. ضع الأطباق مقاس 35 ملم في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة ساعة واحدة للسماح للخلايا العصبية بالالتصاق بالغطاء الذي ينزلق الشفاه بعد ساعة واحدة. أضف ملليلترين إضافيين من الوسائط إلى كل طبق وأعدها إلى الحاضنة لإجراء تسجيل مشبك التصحيح.

أولا ، حدد الصبغة المسماة الخلايا العصبية DRG باستخدام مجهر مع مضان epi. بعد ذلك ، املأ القطب الزجاجي بمحلول داخلي. انقر برفق لإزالة أي فقاعات محاصرة.

ثم ضع القطب في حامل القطب. اخفض القطب الكهربائي إلى الخلية باستخدام مناور دقيق. بمجرد أن يلامس القطب الخلية ، قم بتطبيق شفط لطيف عبر أنبوب الشفط حتى يتم تشكيل ختم محكم.

ثم قم بتثبيت جهد الغشاء عند إمكانات التثبيت المطلوبة. احصل على تكوين مشبك تصحيح الخلية بالكامل عن طريق تطبيق شفط أقوى. لإزالة رقعة الغشاء عند طرف القطب ، بمجرد إنشاء تكوين مشبك تصحيح الخلية بالكامل ، ابدأ التسجيل.

في هذا الإجراء ، قم بإصلاح الخلايا العصبية على زلات الغطاء باستخدام 4٪ بارا فورمالديهايد لمدة ساعة واحدة. ثم قم بتجذر الخلايا العصبية بنسبة 2٪ 20 في PBS لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، احتضان الخلايا في محلول حجب لمدة ساعة واحدة.

يتم تحضين خلايا الاختبار في محلول الانسداد بالإضافة إلى الجسم المضاد الأولي طوال الليل. تترك مجموعة التحكم من الخلايا العصبية لتحتضن بين عشية وضحاها في محلول مانع دون أي أجسام مضادة أولية. في اليوم التالي ، اغسل زلات الغطاء باستخدام المخزن المؤقت PBS ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منهما ، تليها غسلتان مدة كل منهما خمس دقائق مع 1٪ 20 لإزالة الجسم المضاد الأساسي غير المرتبط.

ثم احتضان زلات غطاء الاختبار والتحكم بالجسم المضاد الثانوي المناسب الموسوم بالفلورسنت لمدة 30 دقيقة ، والذي يرتبط بالجسم المضاد الأساسي للسماح بالتصور. بعد ذلك ، اغسل زلات الغطاء باستخدام PB S3 مرات لمدة خمس دقائق لكل منها لإزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائدة. بعد ذلك ، قم بتركيب زلات الغطاء على شريحة زجاجية نظيفة باستخدام وسائط التثبيت.

ثم ضعي طلاء الأظافر الشفاف على حافة زلة الغطاء لتثبيته في مكانه. بمجرد أن تجف ، تصور الخلايا العصبية والتقط الصور باستخدام البرنامج المصاحب للمجهر الفلوري. هذا هو تمثيل حقن داي في العضلات المعدية والنقل إلى الوراء من العضلات إلى DRG.

تصنيف L four و L five DRG هنا. تظهر الخلايا العصبية الواردة في صورة المجال الساطع وتظهر هذه الصورة الفلورية صبغة واحدة تسمى الخلايا العصبية العضلية الواردة. يوضح هذا الرسم البياني كثافة الفلورسنت DII للخلايا العصبية الحسية.

الذروة الكبيرة من الخلايا العصبية غير المسماة وهي مزودة بمعادلة غاوسية لتحديد متوسط الشدة والانحراف المعياري. يمثل الخط الرأسي المتقطع عتبة وضع العلامات على DAI. يتكون الرسم البياني من بيانات من 1047 خلية عصبية مع 167 تم تصنيفها ب dai.

هنا خلية عصبية واردة عضلية تمثيلية مع تحكم جيد في جهد الغشاء. تظهر تيارات الصوديوم عند سالب 20 وسالب 10 وصفر مللي فولت على اليسار وتظهر علاقة الجهد الحالي على اليمين. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تشريح DRGs بسرعة ولكن برفق والحفاظ على المستحضر رطبا بشكل متكرر في رمز الثلج hbss.

بعد هذا الإجراء ، يمكن تسمية الخلايا العصبية الصادرة الأخرى وتحديدها لفهم دورها في علم وظائف الأعضاء.