في المختبر المقايسة المشتركة لتقييم الهجرة العدلية المستحثة المسببة للأمراض عبر الظهارية

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد عدد العدلات التي عبرت طبقة أحادية للخلية الظهارية استجابة للعدوى. يتم تحقيق ذلك عن طريق ترميز الكولاجين قبل زراعة طبقات أحادية الخلية الظهارية بعناية باستخدام مناورة مرشح ترانسويل المقلوب. كخطوة ثانية ، يتم زراعة العامل الممرض البكتيري من أجل إصابة السطح القمي للطبقة الأحادية الظهارية المزروعة على مرشحات ترانسويل ، مما يجعل الخلايا الظهارية تنتج جاذبات كيميائية داخلية العدلات.

بعد ذلك ، تضاف العدلات المعزولة من الدم الكامل إلى الجانب القاعدي الجانبي من الطبقات الأحادية الظهارية المصابة المزروعة على مرشحات عبر البئر لفحص هجرة العدلات من الجانب القاعدي الجانبي إلى الجانب القمي. تم الحصول على النتائج التي تظهر زيادة كبيرة في عدد العدلات الظهارية المهاجرة التي لوحظت استجابة للطبقات الأحادية الظهارية المصابة بناء على التقدير الكمي للبيروكسيداز النخاعي من العدلات المهاجرة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن مناورة مرشح الواجهة المقلوبة لنمو الحواجز الظهارية وإصابة الحواجز الظهارية غير تقليدية ، وبالتالي يمكن أن تكون أقل سهولة بالنسبة لمجموعات البحث غير المألوفة لتأسيسها في مختبرها.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج الأمراض الالتهابية في مجرى الهواء التي تنطوي على عدوى مثل الالتهاب الرئوي أو التليف الكيسي ، لأنه يمكن تطوير علاجات جديدة واختبارها لتقليل كمية الهجرة الظهارية عبر العدلات ، والتي قد تخفف من الآثار الضارة للعدلات المفرطة ، واختراق الحواجز المخاطية. جنبا إلى جنب مع مارك ، وهو زميل إكلينيكي في مختبري ، سيظهر الإجراء كبير الفنيين واهي بريزا وزميل ما بعد الدكتوراه مايكل بيسوس. للبدء في إزالة مساحة نمو 0.33 سم مربع ، Transwells بحجم مسام يبلغ ثلاثة ميكرومتر من العبوة ووضع صفيحة 24 بئر تحتوي على 12 بئرا رأسا على عقب داخل الغطاء.

ارفعي الطبق السفلي وضعيه جانبا. ستكون Transwells الآن مقلوبة. يستريح فوق غطاء لهب اللوحة 24 بئر ، وهو إرقاء للعقم ويترك ليبرد.

باستخدام نقل الآبار المعقمة إلى طبق بتري مقاس 150 × 25 ملم ، وإبقائها في الوضع المقلوب ، قم بعمل ماصة 70 ميكرولترا من محلول الكولاجين المحضر 30 ميكروغرام لكل مليلتر في الإيثانول على غشاء المرشح لكل سطح مقلوب يجب أن يحافظ التوتر على هذا الحجم من المحلول في مكانه حيث لا توجد جدران حول غشاء المرشح عند الوصول إلى سطح الجانب السفلي. احرص على ألا يتساقط محلول الكولاجين على جانب البئر وتجنب تحريك الآبار أثناء إجراء الطلاء. اترك غطاء طبق بتري مغلقا لمدة أربع ساعات على الأقل للسماح للإيثانول بالتبخر للحفاظ على العقم أثناء هذه العملية.

احتفظ بمروحة غطاء المحرك والأشعة فوق البنفسجية مضاءة بعد تعبئة الخلايا الظهارية كما هو موضح في بروتوكول النص. أضف 70 ميكرولترا من محلول الخلية المعلقة Resus من أنبوب سعة 15 مليلتر إلى كل بئر مغلف بالكولاجين المقلوب. امزج معلق الخلية عن طريق قلب الأنبوب برفق بشكل دوري لمنع الخلايا من الاستقرار في قاع الأنبوب سعة 15 مليلتر أثناء بذر الآبار.

بمجرد أن يتم زرع جميع الآبار المقلوبة بالخلايا الظهارية ، استبدل غطاء طبق بتري وضع الخلايا بعناية في حاضنة زراعة الأنسجة في اليوم التالي. أضف ملليلترا واحدا من الوسائط في كل بئر من صفيحة 24 Well المعقمة الأصلية واستخدم hemostat معقم لقلب كل بئر متحول مقلوب في كل بئر يحتوي على مليلتر واحد من الوسائط. أضف 0.2 مل من الوسائط إلى الغرفة العلوية لكل بئر متحول والعودة إلى حاضنة زراعة الأنسجة.

قم بإزالة 24 لوحة بئر تدعم الطبقات الظهارية التي تم زراعتها على الجانب السفلي من أغشية مرشح Transwell لمدة ثمانية أيام على الأقل من الحاضنة. أمسك حافة كل بئر متحول باستخدام hemostat وارفعه من لوحة 24 بئر. اقلب البئر فوق دلو النفايات للتخلص من وسائط الاستزراع من الغرفة الداخلية للبئر.

اغمس كل بئر في دورق غسيل يحتوي على محلول ملح هانك المتوازن مع الكالسيوم والمغنيسيوم أو هانكس بلس لملء الغرفة الداخلية للترانسويل. ثم تخلص من السائل من الغرفة الداخلية في دلو نفايات. كرر هذه الخطوة لثانية.

اغسل في هانك بلس بعد غسلتين. ضع Transwells في صفيحة جديدة سعة 24 بئرا تحتوي على ملليلتر واحد من Hank's Plus. في كل بئر ، راقب الغرفة العلوية لكل بئر لتقييم سلامة طبقة الخلية الظهارية.

يجب ألا يتسرب Hank's Plus إلى الغرفة العلوية في Transwell ويملأها عند وضعه في بئر صفيحة 24 بئر تحتوي على ملليلتر واحد من Hank's Plus. بعد مراقبة كل بئر بعناية ، أضف 0.2 مل من Hanks Plus إلى الغرفة العلوية. ضع اللوحة في الحاضنة لمدة 30 إلى 60 دقيقة لموازنة طبقات الخلايا الظهارية لإجراء مقايسة الهجرة الظهارية عبر العدلات.

أمسك كل بئر بفتحة من صفيحة 24 بئرا من Wash Transwells المتوازنة في Hank's Plus وتخلص من السائل الموجود في البئر العلوي في دلو نفايات. ضع كل بئر متحرك رأسا على عقب في طبق بتري مقاس 150 × 25 ملم إلى ستة من الآبار المقلوبة. أضف 25 ميكرولترا من هانكس بالإضافة إلى ثلاثة من الآبار المقلوبة.

قم بإصابة الخلايا ب 25 ميكرولتر من Pseudomonas أو arosa أو Pao المخفف في Hanks plus المحضر كما هو موضح في بروتوكول النص إلى الآبار الثلاثة الأخيرة المقلوبة تصيب الخلايا ب 25 ميكرولترا من e Coli أو K 12 أو mc 1000 المخففة في Hanks Plus المعدة أيضا كما هو موضح في بروتوكول النص بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في غرفة رطبة لمدة 60 دقيقة. اغسل الآبار عن طريق الإمساك ب hemostat وتقليبها مرة أخرى في طبق غسيل 24 جيدا يحتوي على ملليلتر واحد من Hank's plus. في الغرف السفلية.

أضف 0.2 مل من هانك بلس إلى الغرف العلوية. أمسك Transwell باستخدام hemostat وقم بإزالته من لوح الغسيل الأول. تخلص من السائل من الحجرة العلوية في دلو نفايات.

قبل وضع Transwells في صفيحة غسيل ثانية سعة 24 جيدا تحتوي على ملليلتر واحد من Hanks بالإضافة إلى إضافة 0.2 مل من Hanks plus إلى الغرفة العلوية. كرر هذه الخطوة مرة أخرى ليصبح المجموع ثلاث غسلات. بعد الغسيل الثالث ، تخلص من السائل من الغرف العلوية للآبار المتحولة إلى دلو نفايات باستخدام hemostat ضع ثلاثة من الآبار العابرة غير المصابة في ثلاثة آبار من لوحة هجرة 24 بئر تحتوي على مليلتر واحد من Hanks Plus ، والتي تمثل ماصة التحكم السلبية 10 ميكرولتر من محلول 10 ميكرومولار من FMLP في كل من الآبار الثلاثة من لوحة الهجرة 24 بئر تحتوي على مليلتر واحد من Hanks بالإضافة إلى وضع ثلاثة من الآبار العابرة غير المصابة في ثلاثة آبار من لوحة الهجرة 24 بئر تحتوي على 100 نانومولار FMLP ، والتي تمثل تحكما إيجابيا في قدرة العدلات المعزولة على الهجرة.

ثم ضع الآبار العابرة الثلاثة المصابة ب PAO one والآبار العابرة الثلاثة المصابة ب mc 1000 في ثلاثة آبار مقابلة من لوحة هجرة 24 بئر تحتوي على ملليلتر واحد من هانكس بالإضافة إلى إضافة 0.1 مليلتر من هانكس بالإضافة إلى الغرفة العلوية لكل بئر عابر فوق 0.1 ملليلتر هانكس زائد في كل عبر. حسنا ، أضف بعناية 20 ميكرولترا من تعليق العدلات المحضر كما هو موضح في بروتوكول النص. احتضان لمدة ساعتين للسماح بالهجرة الظهارية عبر العدلات.

بعد ساعتين من الهجرة ، ارفع الآبار عن طريق الإمساك باستخدام hemostat واضغط برفق على الجدران الداخلية للوحة الهجرة المكونة من 24 بئرا. قبل التخلص من الآبار العابرة ، قم بتقييم هجرة العدلات بشكل كبير في الآبار من خلال عرض آبار لوحة الهجرة المكونة من 24 بئرا تحت مجهر مقلوب باستخدام هدف 10 ×. ثم أضف 50 ميكرولترا من 10٪ Triton X 100 إلى كل بئر مستخدم في لوحة الهجرة المكونة من 24 بئرا ، كل معيار وفارغ.

قم بتدوير معايير لوحة ترحيل 24 بئر وفارغة بسرعة منخفضة لمدة 20 دقيقة. عند أربع درجات مئوية. أضف 50 ميكرولتر من عازلة السترات.

اثنان كل بئر يستعمل في ال 24 بئر هجرة لوحة إلى كل معيار وإلى الفراغ تماما. امزج المحتويات في كل عينة جيدا عن طريق سحب المحلول لأعلى ولأسفل خمس مرات على الأقل. ثم انقل 100 ميكرولتر من كل عينة بئر في نسختين إلى نقل لوحة 96 بئر ، و 100 ميكرولتر من كل معيار والفراغ إلى لوحة البئر 96.

بعد الخلط ، أضف 50 ميكرولترا من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 30٪ إلى محلول A BTS والدوامة. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة BTS إلى كل عينة. على لوحة البئر 96 ، اترك اللوحة تتطور لمدة خمس إلى 10 دقائق في الظلام.

لاحظ تطور اللون الأخضر في آبار الصفيحة التي تحتوي على عدلات الليز قبل القراءة بطول موجي يبلغ 405 نانومتر. يمكن رؤية استخدام قارئ الصفيحة الدقيقة لتقييم العدلات العابرة للهجرة الظهارية التي هاجرت بالكامل عبر الطبقة الظهارية إلى الغرفة القمية في البئر السفلي من لوحة الهجرة المكونة من 24 بئرا كما هو موضح هنا باستخدام مجهر ضوئي مقلوب. لوحظ أن عددا قليلا جدا من العدلات تهاجر عبر طبقة ظهارية غير مصابة دون تدرج كيميائي مفروض وتمثل مستويات الخلفية في الفحص.

في المقابل ، كانت وفرة من العدلات transmi واضحة عند توفير تدرج FMLP. أدت إصابة الظهارة ب e coli mc 1000 غير المسببة للأمراض إلى عدد قليل من العدلات المهاجرة العابرة المرئية ، في حين أن العديد من العدلات المهاجرة المتحولة كانت ملحوظة عندما أصيبت الطبقات الظهارية بالهواء الكاذب الممرض للرئة. يتم قياس العدلات التي هاجرت في التجربة عن طريق قياس نشاط بيروكسيداز النخاع.

يرتبط عدد العدلات ارتباطا إيجابيا بكمية نشاط البيروكسيديز المقاسة بعد تحلل العدلات مع القيم التي تظهر علاقة خطية في نطاق أرقام العدلات المختارة للمنحنى القياسي. يهاجر عدد كبير من العدلات عبر الطبقات الظهارية استجابة لتدرج FMLP المقدم ، أو استجابة لطبقة ظهارية مصابة ب PAO واحد. عدد العدلات التي تهاجر في حالة عدم وجود محفزات أو بعد العدوى الظهارية القمية ب E coli MC 1000 غير المسببة للأمراض أقل من حد الكشف عن المقايس.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في خمس ساعات لطلاء الكولاجين وبذر الخلايا الظهارية على مرشحات ترانسويل ، متبوعا بأسبوع واحد على الأقل للسماح للخلايا الظهارية بالنمو. بمجرد أن تصبح الطبقات الأحادية الظهارية جاهزة. يمكن إجراء فحص الهجرة في خمس ساعات ، بما في ذلك عزل العدلات وتحضير البكتيريا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحضير مرشحات transwell في ظروف معقمة لمنع التلوث. يمكن تكييف هذا الإجراء من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بهذه العملية الالتهابية. يمكن إجراء تحليل الخلايا المهاجرة أو الظهارة أو الاستلقاء أو حتى العامل الممرض.