تحليل ديناميات البروتين عن طريق صرف الهيدروجين الطيف الكتلي

الهدف العام من التجربة التالية هو تحليل المرونة التأكيدية في البروتينات والتغيرات التي تطرأ عليها استجابة للبيئة أو ارتباط الترابط أو تفاعلات البروتين البروتيني. يتم تحقيق ذلك عن طريق الحضانة المسبقة للبروتين محل الاهتمام في ظل ظروف مختلفة يشتبه في أنها تؤثر على تأكيد البروتين ، مثل ارتباط الترابط. ثم يتم تخفيف خليط التفاعل إلى أكسيد الديوتيريوم ، ويتم احتضانه لفترات زمنية مختلفة ، ثم يتم تحليله لاحقا بواسطة قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة لتحديد درجة دمج الديوتيترو في العمود الفقري للببتيد.

مجموعات الأميد ، نظرا لأن المناطق المحمية قد انخفضت من دمج deuteros ، فإن مقارنة أطياف الببتيد للتجربة في غياب ووجود شريك ملزم تكشف عن تحول في OID للأطياف بسبب اختلاف الوزن بين البروتون والديوتيرون. المناطق التي تظهر حماية بارزة بعد إضافة شريك ملزم هي مواقع ربط محتملة. اعتمادا على تغطية التسلسل وتوافر الببتيدات المتداخلة ، يمكن تضييق مواقع الربط إلى عدد قليل من الأحماض الأمينية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في طي البروتين ومجال ديناميكيات البروتين ، مثل كيفية طي البروتينات ، وكيف تتكشف ، وكيف تتفاعل مع التأثيرات الفيزيائية والكيميائية مثل زيادة درجة الحرارة أو المعادن الثقيلة. كيف يمكن أن تؤثر تفاعلات الارتباط والبروتين والبروتين المتشابهة على تأكيد البروتين. كما أنه مهم جدا لتطوير أدوية البروتين للتحقق من الطي السليم ومراقبة الجودة العامة.

بشكل عام ، قد يواجه الأفراد الجدد في هذه الطريقة العديد من الصعوبات. إذا لم يتم هضم البروتين ، على سبيل المثال ، جيدا بواسطة البيبسين ، فستكون تغطية التسلسل منخفضة. إذا كان البروتين عرضة جدا للتراكم ، فقد يتجمع أثناء الحضانة أو بعد إضافة المخزن المؤقت للإخماد وسيؤدي إلى انخفاض شدة الإشارة في مطياف الكتلة.

في هذا العرض التوضيحي ، سوف نحقق في ارتباط المرافق الجزيئي للخميرة ، HP 90 بمرافقه كوس ستاي واحد باستخدام قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين STY يرتبط واحد ب HP 90 ويسهل ارتباط العميل عن طريق تثبيط نشاط ABAs في HB التسعين. ابدأ هذا الإجراء بإعداد المخازن المؤقتة والعينات والخرز كما هو مفصل في بروتوكول النص. لتحضير الأعمدة لتبادل الهيدروجين الأميد ، قم بفك جانب واحد من عمود الحماية وإزالة المرشح بإحكام.

قم بربط قمع التعبئة في الطرف المفتوح للعمود. استخدم محولا مقاس 16 بوصة لتوصيل حقنة فارغة سعة خمسة ملليلتر بالمخرج السفلي للعمود. تأكد من إصلاحه بإحكام الغاز في عمود الحماية.

ضع بضع قطرات من مادة حبة الملاط أعلى القمع. اسحب مكبس المحقنة لشفط الملاط عبر القمع إلى عمود الحماية. ضع المزيد من مادة حبة الملاط على القمع واستمر في الإجراء حتى يمتلئ عمود الحماية بالكامل بمادة الخرز.

ثم قم بإزالة القمع قبل وضع الفلتر وحلقة المرشح على الطرف المفتوح بإحكام. قم بربط غطاء العمود على عمود الحماية وإزالة المحقنة من الجانب الآخر. أغلق طرفي أعمدة الحماية بالمقابس.

لتجنب جفاف مادة العمود لإعداد نظام لقياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين. قم أولا بتوصيل عمود المصيدة بالكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء أو نظام HPLC. قم بموازنة العمود عن طريق ضبط معدل تدفق المضخة A على 0.4 مل في الدقيقة مع 0.1٪ حمض الفورميك كمذيب.

بعد معايرة مطياف الكتلة ، قم بتوصيل مخرج HPLC بمصدر مطياف الكتلة. لتحديد الببتيدات الهضمية أولا ، قم بتوصيل عمود Pepin ثم العمود التحليلي بالنظام. قم بإعداد معلمات الكروماتوغرافيا وقياس الطيف الكتلي في برنامج التحكم عن طريق اختيار نوع التدرج وطريقة قياس الطيف الكتلي.

اختر تدرجا طويلا لضمان دقة كروماتوغرافية جيدة. قم بتمكين أطياف الكتلة الترادفية على مطياف الكتلة. قم بإعداد 100 إلى 200 بوم من بروتين الصدمة الحرارية 90 أو HSP 90 في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت H two L.

أضف 100 ميكرولتر من محلول التبريد واخلطه عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. قم بحقن عينة 200 ميكرولتر في منفذ الحقن لصمام الحقن باستخدام حقنة هاميلتون. قم بتبديل صمام الحقن إلى وضع الحقن وابدأ برنامج الكروماتوغرافيا.

بعد ذلك ، حدد الببتيدات الهضمية لبروتين الصدمة الحرارية 90 من خلال البحث في قاعدة بيانات عن الببتيدات الناتجة. خفض درجة حرارة النظام إلى صفر درجة مئوية عن طريق إضافة الماء المثلج. كرر هذه الخطوة بدون قياس الطيف الكتلي الترادفي ومع التدرج الذي سيتم استخدامه لتجربة تبادل الهيدروجين الفعلية.

بالنسبة لبروتين الصدمة الحرارية 90 وSTI واحد ، استخدم تدرجا لمدة 10 دقائق من مذيب 90٪ ، مذيب 10٪ B إلى مذيب 45٪ ، مذيب A 55٪ مذيب B ، حدد أوقات الاحتفاظ بالبتيدات الهضمية المحددة في التدرج المستخدم وقم بإنشاء قائمة تشتمل على تسلسل الببتيد وشحنة الببتيد والحالة ووقت الاحتفاظ. سيتم استخدام هذا لتحديد كل ببتيد بعد تجارب تبادل الهيدروجين. لتحديد واجهات تفاعل بروتين البروتين ، قم أولا بإعداد طريقة قياس الطيف الكتلي والتدرج.

في برنامج التحكم ، استخدم تدرجا خطيا لمدة 10 دقائق من مذيب 90٪ ، مذيب 10٪ B إلى مذيب 45٪. A 55٪ المذيب B تحميل طريقة قياس الطيف الكتلي التي تم تحسينها للكشف عن ما بين 300 إلى 1 ، 500 من الكتلة إلى نسب الشحنة ، على الرغم من أن معظم الببتيدات ستكون أقل من 1000 نسبة الكتلة إلى الشحن. اضبط صمام الحقن في وضع التحميل والصمام ذو المنافذ.

في وضع تحلية التحميل ، اضبط معدل تدفق مضخة التحميل على 0.4 مل في الدقيقة. بعد تشغيل المرجع غير المتغير وعينة التحكم بنسبة 100٪ كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بإعداد 20 إلى 100 مول بيكو من بروتين الصدمة الحرارية 90 بحجم من واحد إلى خمسة ميكرولتر. أضف المخزن المؤقت لأكسيد الديوتيريوم المعدل في درجة الحرارة لرفع حجم العينة إلى 100 ميكرولتر يحتضن للفترة الزمنية الدقيقة التي تم تعريفها مسبقا كما هو موضح في بروتوكول النص.

عند تحديد النطاق الديناميكي للتبادل ، أضف 100 ميكرولتر من البرد المثلج ، وقم بإخماد المخزن المؤقت ، والماصة لأعلى ولأسفل مرتين ، وقم بحقن 200 ميكرولتر بسرعة في صمام حقن HPLC. قم بتبديل صمام الحقن إلى وضع الحقن وابدأ برنامج الكروماتوغرافيا على الفور. بعد دقيقتين ، قم بتبديل الصمام ذو المنافذ الستة من موضع تحميل الملح إلى وضع الملح.

افعل ذلك لكل بروتين على حدة لتحديد دمج الديوتيرون في كل ببتيد في حالة عدم وجود البروتين المتفاعل لتحديد بروتين الصدمة الحرارية المختلط السطحي 90 مع زيادة مرتين على الأقل من STI واحد لتحويل التوازن إلى الحالة المرتبطة ، واحتضان درجة الحرارة المطلوبة حتى يصبح التكوين المعقد في حالة توازن. بعد الحضانة ، أضف عازلة أكسيد الديوتيريوم المعدلة بدرجة الحرارة ليصل حجم العينة إلى 100 ميكرولتر واحتضانها لفترة زمنية محددة بالضبط. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول التبريد المثلج ، وقم بحقن البروتين لأعلى ولأسفل مرتين بسرعة وتشغيله كما كان من قبل.

قم بتحليل البيانات المكتسبة باستخدام البرامج المناسبة واستخدم أوقات الاحتفاظ المحددة للعثور على كل ببتيد في التحليل. احسب OID لتوزيع النظائر للبروتين غير المتغير ولتجارب تبادل الهيدروجين ، قارن دمج deuteros للبروتين المستهدف وحده ومع زيادة شريك الربط. يمكن القيام بذلك تلقائيا باستخدام البرامج التجارية أو يدويا باستخدام برنامج جداول البيانات M ، تم اختبار تفاعل بروتين البروتين المباشر بين HS P 90 و STI one من خلال مقارنة أطياف الببتيد المنقولة جنسيا في غياب ووجود HS P 90 بعد وضع العلامات على أكسيد الديوتيريوم.

يكشف مخطط الفرق الناتج أن الببتيدات في الغالب في TPR اثنين A و TPR two B تظهر حماية قوية في وجود HS P 90 ، مما يشير إلى أن هذه المناطق تتفاعل مع HS P 90. يمكن بسهولة ترشيد الحماية في TPR two A من التركيب البلوري ل STY واحد TPR اثنين A TPR اثنين B في مركب مع ببتيد HS P 90 ، والذي يتم تلوينه وفقا لعدد بروتونات الأميلويد المحمية من دمج DEUTERO. لا يتم دائما ملاحظة مثل هذه الحماية الواضحة في تفاعلات بروتين البروتين.

الحماية في HSP 90 في وجود الأمراض المنقولة جنسيا واحدة ليست واضحة وليست موضعية كما هو الحال في الأمراض المنقولة جنسيا واحدة. تظهر جميع الببتيدات حماية متزايدة قليلا من دمج الديوتيترو. يظهر هنا تمثيل كرتوني للخميرة HS P 90 الملونة وفقا لعدد بروتونات amli المحمية من دمج الديوتيرون ، تعمل STY one على استقرار HS P 90 على مستوى العالم حيث لا تظهر أي منطقة من البروتين مرونة أكبر في وجودها.

ليس من الواضح ما إذا كان هذا الدمج المنخفض للديوتيرون ينشأ من تفاعل مباشر مع ستي واحد أو من خلال تأثيرات خيفية. عند تأكيد وضع العلامات المستمرة HSP 90 ، تم استخدام تبادل الهيدروجين ، وقياس الطيف الكتلي لدراسة ديناميكيات مناطق البروتين المختلفة. تظهر هنا أطياف الببتيد من 43 إلى 62 من مجال ربط النيوكليوتيدات ل HSP 90.

في وجود وعدم وجود الأمراض المنقولة جنسيا واحدا ، تظهر أطياف الببتيد دمجها المعتمد على الوقت للديوتيريوم الذي يزداد مع الحضانة الأطول. تتغير درجة الحماية طوال فترة الحضانة ، مما يدل على اختلاف أكبر في أوقات الحضانة الأقصر وأسعار صرف متشابهة تقريبا في أطول نقطة زمنية. يشير هذا إلى درجة أقل من الاستقرار أو منطقة من التفاعلات الديناميكية مع التفكك والانفصال المتكرر.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على الظروف ثابتة بدقة وأن يكون كل شيء جاهزا قبل بدء تفاعل التبادل. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى للإجابة على أسئلة إضافية مثل موقع مواقع التفاعل في مجمعات البروتين.