المجهر الضوئي الكمية: قياس الخلوية البيوفيزيائية الميزات مع مجهر بصري قياسي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد السمات الفيزيائية الأساسية للعينات الخلوية ، بما في ذلك الكتلة والحجم ، باستخدام مجهر بصري قياسي ومعالجة الصور. يتم تحقيق ذلك من خلال تركيب العينات الخلوية الأولى المزروعة على زلات غطاء زجاجي على شرائح المجهر. بعد ذلك ، يتم الحصول على صور تباين التداخل التفاضلي من خلال التركيز الساطع.

ثم يتم إدخال كل مكدس Z من الصور في برامج معالجة صور MATLAB منفصلة تستخرج البيانات المادية. في النهاية ، يتم الحصول على الخصائص الفيزيائية الأساسية للعينات الخلوية باستخدام قياسات شدة التركيز ، تحت تباين المجال الساطع والفحص المجهري لتباين التداخل التفاضلي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الفحص المجهري الفلوري ، هي أن العينات الخلوية لا تحتاج إلى إصلاح أو تخلل أو تلطيخها.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلية ، مثل كيفية تنظيم الكثافة الخلوية الفرعية أثناء دورة الخلية أو بين مجموعات الخلايا المختلفة التي تساهم في حالة المرض باستخدام مجهر مع كل من DIC و Brightfield والمواصفات الإضافية وفقا لبروتوكول النص ، ابدأ بفتح برنامج دفتر الشرائح وإنشاء شريحة جديدة لجمع الصور. بعد ذلك ، افتح نافذة التركيز وضمن قسم مجموعة المرشحات حدد DIC في علامة تبويب النطاق أسفل قسم المكثف ، اضبط شريط تمرير الفتحة على أقصى موضع يمين. يوفر هذا إضاءة عالية الفتحة العددية ويعزز التقسيم البصري للعينة.

بعد التقاط مكدس DIC للعينة، افتح نافذة التركيز البؤري وحدد فتح. ضمن قسم مجموعة المرشحات، اضبط شريط انزلاق فتحة العدسة على أقصى موضع يسار مغلق بالكامل لتوفير إضاءة منخفضة للنفط المغناطيسي. بعد ضبط شدة الإشارة ، افتح نافذة التقاط الصورة.

سيتم عرض إعدادات الالتقاط ثلاثي الأبعاد من اكتساب مكدس DICZ في قسم مجموعة عوامل التصفية في نافذة التقاط الصورة. حدد المربع المفتوح وحدد وقت التعرض. في قسم معلومات الصورة، قم بتسمية الصورة وحدد ابدأ لبدء الحصول على صور Zack.

ثم قم بتصدير مكدسات Z وفقا لبروتوكول النص لإجراء قياسات الحجم مرة واحدة في برنامج H-T-D-I-C MATLAB بعنوان JoVE HT DCO V واحد M تحت القسم صفر ، قم بتحديث متغير دليل التبعيات عن طريق نسخ ولصق الدليل الذي يحتوي على hilbert. تحويل DM وحافة sobel اكتشاف ملفات M من المستكشف. بين علامات الاقتباس المفردة التالية لدليل التبعيات يساوي تنفيذ القسم صفر من برنامج joco HT DCO V واحد M.

في القسم الأول ، قم بتحديث دليل الصور عن طريق نسخ ولصق الدليل الذي يحتوي على صور التركيز البؤري في شكل TIF النقطي. بين علامات الاقتباس الفردية ، قم بتشغيل هذا القسم مرة واحدة فقط لمحاذاة الصور وتدويرها. بالنسبة لتحويل هيلبرت ، قم بتشغيل القسم الثاني من التعليمات البرمجية سيظهر مربع حوار بعنوان تعريف معلمات HT DIC.

ثم أدخل رقم المستوى البؤري حيث تكون صورة DIC للعينة في بؤرة التركيز ، والدقة الجانبية ، والدقة المحورية ، وزاوية دوران صورة DIC اللازمة لإجراء تحويل هيلبرت ، وأخيرا ، منطقة حجم الاهتمام. ثم انقر فوق موافق. ستظهر صورة للمستوى البؤري DIC المحدد بواسطة رقم المستوى البؤري مع مربع أزرق.

ضع المربع فوق الميزة ذات الاهتمام، مثل الخلية. بمجرد وضع المربع فوق المنطقة المطلوبة ، انقر نقرا مزدوجا داخل B.يجب أن يكون تباين الصورة بحيث تظهر الميزات الداكنة على اليسار بينما تظهر الميزات الساطعة على اليمين. اسحب المربع الأزرق فوق منطقة الاهتمام وأعد تشكيله حسب الضرورة.

بعد ذلك ، تحت القسم الثالث ، لإنشاء قناع مستطيل ، un سطر التعليق 1 6 7 وسطر التعليق 1 7 0 قم بتنفيذ القسم الثالث من البرنامج بالنقر فوق الصورة وسحب الماوس لبدء تحديد القناع المستطيل. ثم انقر نقرا مزدوجا فوق المربع لقبوله. لإنشاء قناع مرسوم يدويا ، قم بالتعليق على سطر 1 6 7 و un سطر التعليق 1 7 0 قبل تنفيذ القسم الثالث بالنقر فوق القناع المطلوب ورسمه بالماوس ، انقر نقرا مزدوجا فوق القناع لقبوله بعد تشغيل القسم الرابع ، لإنشاء مكدسات الصور المحولة من هيلبرت وفقا لبروتوكول النص يدير القسم الخامس.

لتحسين تجزئة الصور لصور المقطع العرضي xz لمنطقة الاهتمام. يظهر الشكل 500 الذي أنتجه البرنامج يعرض ثلاثة أنواع مختلفة من التباين. يعتمد نجاح الخوارزمية في العثور على حدود الخلية على مزيج من القناع المستخدم وقيمة العتبة عند السطر 2 و 2 و 9 من البرنامج تبدأ بقيمة 0.5 وضبط قيمة العتبة وإعادة تشغيل هذا القسم من البرنامج حتى يتم تحقيق المخطط التفصيلي المناسب في أحد الأعمدة.

إذا كان المخطط التفصيلي هو الأفضل في العمود الأول، في تجزئة DIC، استخدم القسم السادس لتحديد الحجم. إذا أعطى العمود الثاني أفضل النتائج ، فقم بتشغيل القسم السابع لتحديد حجم الخلية من هيلبرت ، وتحويل صور DIC إذا أعطى العمود الثالث النتائج المثلى ، استخدم صور تحويل هيلبرت المصفاة أثناء تشغيل القسم الثامن لتحديد الحجم لأخذ قياسات الكتلة في برنامج NIQ PM MATLAB وبعنوان JO VCO NI qpm V1 M تحت القسم صفر. قم بتحديث موقع تبعيات الدلائل الثلاثة ، ودليل BRIGHTFIELD و DIC بعد تشغيل القسم الأول ، وقم بتشغيل القسم الثاني في مربع الحوار بعنوان تحديد معلمات N-I-Q-P-M أدخل رقم المستوى البؤري حيث تكون صورة المجال الساطع للعينة في التركيز ، والدقة الجانبية ، والدقة المحورية ، ومنطقة حجم الاهتمام.

ثم انقر فوق موافق. ستظهر صورة للمستوى البؤري للمجال الساطع المحدد بواسطة رقم المستوى البؤري مع مربع أزرق. بعد ضبط التركيز إذا لزم الأمر عن طريق إعادة تشغيل القسم الثاني ، اسحب المربع حول الصورة وحدد عقد المربع واسحبه لتغيير حجمه قبل النقر المزدوج داخل المربع لقبوله.

بمجرد إنشاء كومة من صور المجال الساطع عن طريق تشغيل القسم الثالث ، قم بتشغيل القسم الرابع لإنشاء خريطة الطور وصور DIC الزائفة والمقارنات مع صور المجال الساطع وصورة DIC الحقيقية عندما تكون صور DIC الزائفة وصور DIC الحقيقية متشابهة قدر الإمكان ، قم بتشغيل القسم الخامس أ أو خمسة ب الذي يسمح للمستخدم بتحديد الخلية لإنشاء خريطة كثافة الكتلة ، الكتلة الكلية والرسم البياني لكثافة الخلية صحيحة. تعد إضاءة العينة أثناء الحصول على صورة التركيز البؤري أمرا بالغ الأهمية للتنفيذ الناجح لخوارزمية N-I-Q-P-M و H-T-D-I-C. يوضح هذا الشكل إضاءة NA المنخفضة والعالية تحت كل من DIC وتباين المجال الساطع لكرة البوليسترين وخط خلية سرطان القولون والمستقيم البشري SW ستة 20.

توضح هذه اللوحات التصوير الأمثل ل N-I-Q-P-M وتعرض هذه الصور المثلى ل HT DIC. توضح هذه الصور اعتماد المعلمات لخوارزمية NIQ PM ، مما يسلط الضوء على كل من التطبيقات الناجحة وغير الناجحة. نستكشف هنا ملف تعريف الطور لكرة البوليسترين بقطر 4.8 ميكرومتر.

الملف الشخصي المتوقع معروف نظريا وبالتالي يمكن مقارنته مباشرة بإعادة بناء NIQ PM. تقدم هذه اللوحات أفضل إعادة بناء يمكن الحصول عليها لتأثيرات حيود الكرة على كل من حدود الكرة وداخلها تمنع إعادة البناء المستقرة في جميع النقاط على الكرة. يمكن التقاط المنطقة الوسطى من الكرة باستخدام N-I-Q-P-M مع خطأ بنسبة مئوية من واحد إلى 5٪ كما هو موضح في العينات الخلوية للوحة L التي لا تعرف خصائص الطور.

يمكن إعادة بناء بداهة باستخدام NIQ PMM جنبا إلى جنب مع إجراء لمقارنة صورة DIC الزائفة بصورة DIC الفعلية. يحتوي N-I-Q-P-M على معلمة مجانية واحدة. المستوى الموجود في مكدس صور الحقل الأيمن الذي يتم توسيط العملية الحسابية فيه.

يجب ضبط هذا المستوى البؤري المركزي حتى تبدو صور DIC الزائفة وصور DIC الحقيقية متشابهة قدر الإمكان. يتم تقديم صورة DIC زائفة خارج نطاق التركيز ، وصورة DIC زائفة مثالية وصورة DIC المقابلة للخلية التي تم التقاطها بإضاءة NA 0.9. ومن المثير للاهتمام أن أفضل خريطة طور وصورة DIC الزائفة المقابلة لا تتوافق بالضرورة مع صورة المجال الساطع في التركيز كما هو موضح في هذه اللوحات.

أخيرا ، كما هو موضح هنا الخطوات المتضمنة في خوارزمية معالجة الصور H-T-D-I-C من DIC من خلال صور التركيز تحت NA يساوي 0.9 إضاءة ، يتم إجراء تحويل هيلبرت لإزالة الإغاثة الأساسية لصور DIC. يأتي هذا مع بعض التعتيم على طول المحور البصري الذي يمكن إزالته من تصفية التمرير العالي. يتم تقسيم هذه الصور النهائية بسهولة لتحديد المساحة في كل مستوى مقطع عرضي للعينة لاستنتاج الحجم الخلوي الكلي.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الإضاءة الصحيحة لتصوير التباين التفاضلي للحقل الساطع بعد هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل الفحص المجهري الفلوري من أجل الإجابة على أسئلة إضافية باستخدام تحديد موقع قوة الأرضية مع خرائط كثافة العينة.