المجهر الضوئي الكمية: قياس الخلوية البيوفيزيائية الميزات مع مجهر بصري قياسي

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس الخصائص الفيزيائية الأساسية للعينات الخلوية، بما في ذلك الكتلة والحجم، باستخدام مجهر ضوئي قياسي ومعالجة الصور. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تثبيت العينات الخلوية التي نمت على شرائح غطاء زجاجية فوق شرائح مجهرية. بعد ذلك، يتم الحصول على صور بمجال مضيء وصور بتباين التداخل التفاضلي عبر مختلف مستويات التركيز.

بعد ذلك، يتم إدخال كل مصفوفة صور Z في برامج معالجة صور MATLAB منفصلة لاستخراج البيانات الفيزيائية. وفي النهاية، يتم الحصول على الخصائص الفيزيائية الأساسية للعينات الخلوية باستخدام قياسات الكثافة عبر التركيز، تحت مجهر التباين الميداني المضيء ومجهر تباين التداخل التفاضلي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل المجهر الفلوري في أن العينات الخلوية لا تحتاج إلى تثبيت أو نفاذية أو صبغ.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال بيولوجيا الخلية، مثل كيفية تنظيم الكثافة دون الخلوية خلال دورة الخلية أو بين المجموعات الخلوية المختلفة التي تساهم في حالة مرضية. باستخدام مجهر يتمتع بقدرات التصوير بالتباين التفاضلي (DIC) والمجال المضيء (brightfield) ومواصفات إضافية وفقاً لبروتوكول النص، ابدأ بفتح برنامج slide book وإنشاء شريحة جديدة لجمع الصور. بعد ذلك، افتح نافذة التركيز (focus window) ومن قسم ضبط المرشح (filter set) اختر DIC. وفي علامة تبويب المجهر (scope tab) ضمن قسم المكثف (condenser)، اضبط شريط منزلق الفتحة إلى أقصى اليمين؛ حيث يوفر ذلك إضاءة بفتحة عددية عالية ويعزز من عملية القطع البصري للعينة.

بعد التقاط مجموعة صور DIC للعينة، افتح نافذة التركيز (focus window) واختر فتح (open). في قسم مجموعة المرشحات (filter set)، حرك شريط منزلق الفتحة إلى أقصى اليسار ليغلق تماماً، وذلك لتوفير إضاءة ذات فتحة عددية (NA) منخفضة. بعد ضبط شدة الإشارة، افتح نافذة التقاط الصور.

ستظهر إعدادات الالتقاط ثلاثي الأبعاد من مجموعة صور DICZ المكتسبة في قسم مجموعة المرشحات بنافذة التقاط الصور. حدد المربع المفتوح وحدد زمن التعريض. في قسم معلومات الصورة، قم بتسمية الصورة واضغط على "بدء" لبدء عملية اكتساب صور Zack.

ثم قم بتصدير مجموعات Z stacks وفقاً للبروتوكول النصي لإجراء قياسات الحجم باستخدام برنامج MATLAB المسمى JoVE HT DCO V one M في H-T-D-I-C. في القسم zero، قم بتحديث متغير دليل التبعيات (dependencies directory variable) عن طريق نسخ ولصق الدليل الذي يحتوي على ملفات hilbert. Transform DM و sobel edge Detect M من مستعرض الملفات (explorer)، وذلك بين علامتي الاقتباس المفردتين التي تلي dependencies directory =. قم بتنفيذ القسم zero من برنامج joco HT DCO V one M.

في القسم الأول، قم بتحديث دليل الصور عن طريق نسخ ولصق الدليل الذي يحتوي على صور التركيز البؤري (through focus) بصيغة dot TIF. قم بتشغيل هذا القسم مرة واحدة فقط بين علامتي الاقتباس المفردتين لمحاذاة الصور وتدويرها. ولإجراء تحويل هيلبرت (hilbert transform)، قم بتشغيل القسم الثاني من الكود، حيث سيظهر مربع حوار بعنوان Define HT DIC parameters.

ثم أدخل رقم المستوى البؤري الذي تكون فيه صورة DIC للعينة في بؤرة التركيز، والدقة الجانبية، والدقة المحورية، وزاوية دوران صورة DIC المطلوبة لإجراء تحويل هيلبرت (hilbert transform)، وأخيراً، حجم المنطقة المحددة للاهتمام. ثم انقر فوق موافق. ستظهر صورة للمستوى البؤري DIC المحدد برقم المستوى البؤري مع وجود مربع أزرق.

ضع المربع فوق الميزة المراد دراستها مثل الخلية. بمجرد وضع المربع فوق المنطقة المطلوبة، انقر نقراً مزدوجاً داخل B. يجب أن يكون تباين الصورة بحيث تظهر الميزات الداكنة على اليسار بينما تظهر الميزات الساطعة على اليمين. اسحب المربع الأزرق فوق المنطقة المراد دراستها وأعد تشكيله حسب الضرورة.

بعد ذلك، وفي القسم الثالث، لتوليد قناع مستطيل، قم بإزالة التعليق عن السطر 1 6 7 ووضع تعليق على السطر 1 7 0، ثم نفذ القسم الثالث من البرنامج عن طريق النقر على الصورة وسحب الماوس للبدء في تحديد القناع المستطيل. بعد ذلك، انقر نقراً مزدوجاً على المربع لقبوله. ولتوليد قناع مرسوم يدوياً، قم بوضع تعليق على السطر 1 6 7 وإزالة التعليق عن السطر 1 7 0 قبل تنفيذ القسم الثالث؛ وذلك بالنقر ورسم القناع المطلوب باستخدام الماوس، ثم انقر نقراً مزدوجاً على القناع لقبوله. بعد تشغيل القسم الرابع لإنشاء مجموعات صور محولة بنظام Hilbert وفقاً للبروتوكول النصي، قم بتشغيل القسم الخامس.

لتحسين تقسيم الصور في الصور المقطعية xz لمنطقة الاهتمام. يظهر الشكل 500 الناتج عن البرنامج ثلاثة أنواع مختلفة من التباين. يعتمد نجاح الخوارزمية في تحديد حدود الخلية على مزيج من القناع المستخدم وقيمة العتبة في السطر 2, 2, 9 من البرنامج؛ ابدأ بقيمة 0.5 وقم بتعديل قيمة العتبة وأعد تشغيل هذا القسم من البرنامج حتى يتم تحقيق التحديد الصحيح في أحد الأعمدة.

إذا كان التحديد هو الأفضل في العمود الأول، فاستخدم القسم السادس لتحديد الحجم في تجزئة DIC. أما إذا أعطى العمود الثاني نتائج مثالية، فقم بتشغيل القسم السابع لتحديد حجم الخلية من تحويل هيلبرت (hilbert)، وبدلاً من ذلك، إذا أعطى العمود الثالث النتائج المثالية، فاستخدم صور DIC بتحويل هيلبرت المفلترة بمرشح فورير (forer filtered) أثناء تشغيل القسم الثامن لتحديد الحجم لأخذ قياسات الكتلة في برنامج NIQ PM MATLAB والمعنون بـ JO VCO NI qpm V1 M تحت القسم صفر. قم بتحديث موقع تبعيات الأدلة الثلاثة، ودليل BRIGHTFIELD وDIC، وبعد تشغيل القسم الأول، قم بتشغيل القسم الثاني؛ وفي مربع الحوار المعنون بـ define N-I-Q-P-M parameters، أدخل رقم المستوى البؤري الذي تكون فيه صورة المجال المضيء (bright field) للعينة في بؤرة التركيز، والدقة الجانبية، والدقة المحورية، وحجم المنطقة المختارة (region of interest).

بعد ذلك انقر فوق موافق. ستظهر صورة للمستوى البؤري للمجال المضيء المحدد بواسطة رقم المستوى البؤري مع مربع أزرق. بعد ضبط التركيز إذا لزم الأمر عن طريق إعادة تشغيل القسم الثاني، قم بسحب المربع حول الصورة وحدد عقد المربع واسحبه لتغيير حجمه قبل النقر المزدوج داخل المربع لقبوله.

بمجرد إنشاء مجموعة من صور المجال المضيء (brightfield) عن طريق تشغيل القسم الثالث، قم بتشغيل القسم الرابع لإنشاء خريطة الطور، وصور DIC الزائفة، والمقارنات مع صور المجال المضيء وصورة DIC الحقيقية. عندما تكون صور DIC الزائفة وصور DIC الحقيقية متشابهة قدر الإمكان، قم بتشغيل القسم 5-أ أو 5-ب الذي يتيح للمستخدم تحديد حدود الخلية لإنشاء خريطة كثافة الكتلة، والكتلة الإجمالية، ومخطط توزيع كثافة الخلية الصحيح. إن تصحيح إضاءة العينة أثناء عملية الحصول على الصور عبر التركيز (through focus) أمر بالغ الأهمية للتنفيذ الناجح لخوارزمية N-I-Q-P-M و H-T-D-I-C. يوضح هذا الشكل الإضاءة ذات الفتحة العددية (NA) المنخفضة والعالية تحت تباين DIC والمجال المضيء لكل من كرة بولي ستيرين وخط خلايا سرطان القولون والمستقيم البشري SW six 20.

توضح هذه اللوحات التصوير الأمثل لـ N-I-Q-P-M، بينما تعرض هذه اللوحات التصوير الأمثل لـ HT DIC. وتظهر هذه الصور اعتماد خوارزمية NIQ PM على المعاملات، مما يسلط الضوء على كل من عمليات التنفيذ الناجحة وغير الناجحة. نستكشف هنا ملف الطور لكرة من البوليسترين بقطر 4.8 micrometer.

إن المقطع المتوقع معروف نظرياً وبالتالي يمكن مقارنته مباشرة بإعادة بناء NIQ PM. تعرض هذه اللوحات أفضل إعادة بناء يمكن الحصول عليها لتأثيرات حيود الكرة، حيث تمنع هذه التأثيرات عند حدود الكرة وفي داخلها إعادة البناء المستقرة في جميع نقاط الكرة. يمكن التقاط المنطقة المركزية من الكرة باستخدام N-I-Q-P-M بنسبة خطأ تتراوح من 1% إلى 5% كما هو موضح في اللوحة L للعينات الخلوية التي لا تكون خصائص طورها معروفة.

يمكن إعادة بناء المعلومات المسبقة (A priori) باستخدام نموذج NIQ PMM بالتزامن مع إجراء لمقارنة صورة DIC وهمية بصورة DIC فعلية. يحتوي N-I-Q-P-M على معلمة حرة واحدة، وهي المستوى في مكدس صور المجال الأيمن الذي يتمركز عنده الحساب.

يجب ضبط هذا المستوى البؤري المركزي حتى تبدو صور pseudo DIC وصور DIC الحقيقية متشابهة قدر الإمكان. ويُعرض هنا صورة pseudo DIC خارج نطاق التركيز، وصورة pseudo DIC مثالية، وصورة DIC المقابلة للخلية والتي تم التقاطها بفتحة عددية (NA) للإضاءة تبلغ 0.9. ومن المثير للاهتمام أن خريطة الطور الأفضل وصورة pseudo DIC المقابلة لها لا تتطابق بالضرورة مع صورة حقل مضيء (bright field) في نطاق التركيز، كما هو موضح في هذه اللوحات.

أخيراً، تُعرض هنا الخطوات المتبعة في خوارزمية معالجة الصور H-T-D-I-C من صور DIC عبر البؤرة تحت إضاءة NA equals 0.9؛ حيث يتم إجراء تحويل هيلبرت (hilbert transform) لإزالة تأثير التضاريس السطحية (base relief) من صور DIC. ويصاحب ذلك بعض التمويه على طول المحور البصري، وهو ما يمكن إزالته عن طريق ترشيح التمرير العالي (high pass filtering). ومن ثم، يمكن تقسيم هذه الصور النهائية بسهولة لتحديد المساحة في كل مستوى مقطعي من العينة لاستنتاج الحجم الخلوي الإجمالي.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الإضاءة الصحيحة للتصوير بالمجال الساطع أو تباين التداخل التفاضلي بعد هذا الإجراء. كما يمكن إجراء طرق أخرى مثل المجهر الفلوري للإجابة على أسئلة إضافية باستخدام التوضع المشترك لقوة الأرضية مع خرائط كثافة العينة.