إعداد هيدروكسي PAAm الهلاميات المائية ليتيح فصل آثار Mechanotransduction الإشارات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطوير استراتيجية بسيطة وفعالة لتثبيت أي بروتين مستهدف على هيدروجيلات البولي أكريلاميد من أجل التحكم المستقل في مختلف معايير البيئة الدقيقة للخلية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق توزيع محلول البروتين على سطح ختم PDMS. وتتمثل الخطوة الثانية في تجفيف السطح المهيكل لختم PDMS بعناية باستخدام تدفق ثابت من غاز النيتروجين عالي النقاء.

بعد ذلك، يتم وضع الختم المغطى بالبروتين بحيث يكون السطح المهيكل ملامساً لسطح الهيدروجيل المجفف، وتُطبق نقاط ضغط خفيفة على الجزء العلوي من ختم PDMS لضمان تلامس جيد بين الميزات الدقيقة للختم وسطح الهيدروجيل. وتتمثل الخطوة النهائية في إزالة ختم PDMS برفق من سطح الهيدروجيل وتنظيف الختم بعد تحديد مناطق عدم الطباعة. وباستخدام BSA، يمكن تثبيت الخلايا على سطح الهيدروجيل ذي النمط الدقيق. وفي النهاية، يُستخدم مجهر فلوري مقلوب لرصد الميزات الدقيقة للبروتين.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التحويل الميكانيكي، مثل المساهمة النسبية لخصائص المصفوفة خارج الخلوية، على سبيل المثال، الصلابة، أو كثافة ربيطات الخلايا، أو طبيعة البروتين. وفيما يخص عملية التحويل لعدم الالتصاق، يُوصى بتنفيذ هذا الإجراء داخل خزانة استنشاق كيميائية. ابدأ بوضع شرائح غطاء زجاجية دائرية بقطر 25 مليمتر في طبق بيتري، وادهنها بمحلول هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.1 مولار لمدة خمس دقائق.

أزل محلول هيدروكسيد الصوديوم واغمر الشرائح الغطائية بالكامل في ماء مقطر مزدوج (DD H2O) معقم، ثم هزها برفق لمدة 20 دقيقة على لوح هزاز، ثم تخلص من الماء المقطر المزدوج المعقم وأضف المزيد منه لغمر الشرائح الغطائية بالكامل وهزها برفق لمدة 20 دقيقة أخرى. انزع الشرائح الغطائية باستخدام ملاقط معقمة وضعها في طبق بتري جديد. وبجعل الجانب المنشط متجهًا للأعلى، جفف الشرائح الغطائية بتدفق ثابت من غاز النيتروجين عالي النقاء.

بمجرد جفاف شرائح الغطاء، أعدها إلى غطاء زراعة الخلايا المعقم وقم بدهن طبقة رقيقة من trimethyl propyl acrl على الجانب المنشط من كل شريحة. اتركها لمدة ساعة واحدة. اغسل شرائح الغطاء الزجاجية جيداً باستخدام sterile DD H2O.

ثم اغمر شرائح التغطية في DD H2O معقمة في طبق بتري جديد. أحكم إغلاق طبق بتري باستخدام البارافيلم وضعه على لوح هزاز تحت تحريك خفيف لمدة 10 دقائق. وأخيرًا، استخدم ملاقط معقمة ذات رؤوس دقيقة لنقل شرائح التغطية من DDH two O إلى طبق بتري جديد.

مع جعل الوجه المنشط للأعلى. غطِّ الطبق بورق ألومنيوم لمنع التصاق الغبار بشرائح التغطية، واحفظه في درجة حرارة الغرفة في مكان جاف. لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير 5 mL من محلول هيدروجيل hydroxy poly acrylamide المعقم و 100 µL من محلول ammonium per sulfate حديث التحضير بتركيز 10%.

كما هو موضح في نص البروتوكول، أضف 2.5 µL من tetra methylene diamine، و 25 µL من محلول ammonium per sulfate إلى محلول hydroxy poly acrylamide hydrogel. لبدء عملية البلمرة، امزج المحلول عن طريق السحب والإخراج بالماصة ثلاث مرات متتالية دون إدخال فقاعات تحت ظروف معقمة داخل غطاء معقم، ثم ضع قطرة بحجم 25 µL من محلول hydroxy poly acrylamide hydrogel على شريحة غطاء دائرية بقطر 25 mm، وضع فوراً شريحة غطاء زجاجية دائرية بقطر 22 mm فوق القطرة لضغط محلول hydroxy poly acrylamide hydrogel. كانت شريحة الغطاء الزجاجية بقطر 22 mm قد تم تنشيطها مسبقاً بتعريضها لمدة سبع دقائق في جهاز تنظيف بالأوزون والأشعة فوق البنفسجية (UV ozone cleaner).

قم بتوسيط شريحة الغطاء الزجاجية باستخدام ملقط معقم وقم بتسوية أي فقاعات. اترك هيدروجيل hydroxy poly acrylamide ليبلمر في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. قم بقلب محلول هيدروجيل hydroxy poly acrylamide المتبقي في الأنبوب يدويًا.

لمتابعة اكتمال عملية البلمرة، اغمر شرائح الغطاء بالكامل في sterile DD H₂O. افصل شريحة الغطاء الزجاجية مقاس 22 مليمتر بعناية عن طريق إدخال حافة شفرة حلاقة بين شريحة الغطاء الزجاجية مقاس 22 مليمتر وطبقة hydroxy poly acrylamide hydrogel. اغسل hydroxy poly acrylamide hydrogel ثلاث مرات باستخدام sterile PBS واترك الهلام مغموراً بالكامل في sterile PBS للحفاظ على الترطيب.

تم تصنيع أختام البولي ثنائي ميثيل سيلوكسان أو PDMS الدقيقة المستخدمة في هذا الإجراء كما هو موضح في البروتوكول النصي. ضع أختام PDMS الدقيقة في محلول من الإيثانول والماء بنسبة 50 إلى 50، ثم قم بمعالجتها بالموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة. جفف الأختام بتدفق من غاز النيتروجين وضعها بحيث يكون النمط للأعلى في جهاز تنظيف بالأوزون والأشعة فوق البنفسجية لمدة سبع دقائق.

ضع قطرة بحجم 150 µL من محلول البروتين المطلوب تحت غطاء معقم على السطح ذو البنية المجهرية لـ A-P-D-M-S. تم استخدام Stamp FI nin في هذا العرض التوضيحي. قم بتوزيع محلول البروتين على سطح الختم عن طريق تحريكه باستخدام رأس ماصة معقم نحو كل زاوية من زوايا الختم.

اترك محلول البروتين ليمتصه ختم PDMS لمدة 60 دقيقة. وتحت غطاء التعقيم هذا، أطفئ المصابيح لتجنب تلف البروتين. بعد ذلك، انقل شرائح التغطية المطلية بهيدروجيل هيدروكسي بولياكريلاميد إلى طبق بتري جديد.

أزل فائض محلول PBS من سطح ركائز هيدروجيل بولي أكريلاميد الهيدروكسي باستخدام تيار منخفض من النيتروجين تحت ظروف معقمة. أوقف الإجراء بمجرد عدم ملاحظة أي آثار لمياه راكدة على سطح الهيدروجيل.

يجب عدم تجفيف الهلام تماماً في هذه المرحلة. جفف السطح المهيكل لختم PDMS بعناية باستخدام تدفق ثابت من غاز النيتروجين عالي النقاوة. أمسك الختم المغلف بالبروتين باستخدام ملاقط الأنسجة الورقية، ثم ضع السطح المهيكل بحيث يلامس سطح الهيدروجيل المجفف.

قم بتطبيق نقاط ضغط وجيزة باستخدام طرف الملاقط على الجزء العلوي من ختم PDMS لضمان التلامس الجيد بين الميزات الدقيقة للختم وسطح الهيدروجيل، واترك ختم PDMS على سطح الهيدروجيل لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة ختم PDMS برفق من هيدروجيل hydroxy poly acrylamide باستخدام ملاقط الأنسجة الجراحية، ونظف الختم عن طريق الغمر في محلول إيثانول ومياه لمدة 15 دقيقة. اغسل هيدروجيل hydroxy poly acrylamide المختوم جيداً من خلال ثلاث عمليات تبديل لـ PBS في ظروف معقمة لمدة 10 دقائق لكل عملية تبديل.

بعد غسلة PBS الأخيرة، أضف محلولاً معقماً من BSA واحضن العينة طوال الليل عند درجة حرارة أربع درجات مئوية مع التقليب اللطيف على لوحة هزازة. سيعمل ذلك على سد المناطق غير المطبوعة في اليوم التالي. اغسل هيدروجيل الهيدروكسي بولي أكريلاميد المطبوع جيداً من خلال ثلاث عمليات تبديل لـ PBS في ظروف معقمة لمدة 10 دقائق لكل عملية تبديل.

يمكن تخزين هيدروجيلات hydroxy poly acrylamide المطبوعة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. وتظهر النتائج وجود ارتباط خطي بين تطور صلابة هيدروجيلات hydroxy poly acrylamide وكمية الرابط التشابكي bis acrylamide. كما توضح صور epifluorescence للأنماط الدقيقة المستطيلة الصفائحية المودعة على هيدروجيلات hydroxy poly acrylamide بثلاث درجات صلابة مختلفة إمكانية الضبط المستقل لهندسة النمط الدقيق وصلابة المصفوفة. ويمكن تعديل كثافة ربيطات الخلايا عن طريق تغيير تركيز محلول البروتين المستخدم لتحضين طوابع PDMS.

تظهر هنا صورتان فلوريسنتيتان ناتجان عن عمليات طباعة تلامسية دقيقة متتالية. خطوط من الفيبرونيكتين باللون الأحمر واللامينين باللون الأخضر، متقاطعة بزاوية 90 درجة، وخطوط من الفبرين واللامينين والكولاجين تمت طباعتها تلامسياً بدقة وبشكل متتالٍ على ركيزة من هيدروجيل هيدروكسي بولي أكريلاميد بضغط 25 kilo pascal. وعندما تم استزراع الخلايا الأولية على أسطح هيدروجيل هيدروكسي بولي أكريلاميد مطلية بشكل متجانس ومزخرفة بنمط دقيق، بلغت حيوية الخلايا 80% على الأقل لمدة تصل إلى ثلاثة أيام بعد الاستزراع.

لوحظ أيضاً أن الخلايا تتكاثر بشكل أكبر على الركائز الصلبة مقارنة بالركائز الرخوة. وعندما زُرعت على أنماط مجهرية مستطيلة مغلفة ببروتين الفيبرونيكتين، ومودعة على هيدروجيلات من الهيدروكسي بولي أكريلاميد بثلاث درجات مختلفة من الصلابة، أظهرت الخلايا البطانية الأولية كثافة منخفضة في ألياف الأكتين ونواة مستديرة على الركيزة الرخوة.

تكون ألياف الأكتين على الركائز الأكثر صلابة أكثر استقامة وسماكة، وتكون النواة مشوهة بعد تطورها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التحويل الميكانيكي لاستكشاف الدور الفردي لمعاملات البيئات الدقيقة للخلايا في مجموعة واسعة من الأنظمة الخلوية، مثل الخلايا الأولية أو الخلايا الجذعية، أو على مستوى الأنسجة، أو الكائنات النموذجية، أو الأنماط، أو التركيبة السكانية، أو أنظمة الأعضاء.