الزخرفة البروتينات النشطة بيولوجيا أو الببتيدات على استخدام الكيمياء الضوئية للتطبيقات البيولوجية المائية

الهدف العام من هذه المنهجية هو إنشاء أنماط بروتينية مكانية نشطة بيولوجياً ومثبتة يمكن استخدامها لدراسة الاستجابات الخلوية. وتسمح هذه الطريقة بمحاكاة الإشارات الموجودة داخل الجسم الحي باستخدام استراتيجيات المواد الحيوية. كما تتيح هذه التقنية المحاكاة الدقيقة لبعض دوافع الإشارات التي لا يمكن تحقيقها باستخدام طرق الزرع القياسية، مثل عوامل النمو المتسلسلة، والتواصل بين الخلايا، والإشارات الكيميائية الحيوية المحددة مكانياً.

تكمن أهمية هذا البروتوكول مقارنة بالطرق الحالية في توفيره وسيلة مبسطة لضبط صلابة الركيزة ونمط توزيع البروتين. وبينما يمكن لهذه الطريقة تعزيز تقنيات هندسة الأنسجة والطب التجديدي، فإنه يمكن تطبيقها أيضًا لدراسة أنظمة أخرى مثل تطور الأنسجة ومصير الخلايا الجذعية. للبدء، قم بتحضير المحاليل المخزنة للمكون الرئيسي للهيدروجيل، وهو polyethylene glycol diacrylate، والبادئ الضوئي lithium phenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylphosphinate، وبروتين المصفوفة خارج الخلوية fibronectin، تحت ظروف معقمة كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق.

قم بتعقيم كل محلول بالترشيح باستخدام مرشح سرنجة بمقاس 0.22 ميكرون قبل استخدام أو تخزين الحصص الفردية. بعد ذلك، غلف محلول PEG-DA بورق الألمنيوم لحمايته من الضوء. غلف المحلول الأم للمبدئ الضوئي بورق الألمنيوم لحمايته من الضوء، واحفظ المحلول المُحضّر عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى عدة أشهر.

إذا كان المحلول المخزون من الفيبرونكتين مجمداً، فاترك العينة المعقمة تذوب على الثلج لعدة ساعات أو في درجة حرارة 4 °C طوال الليل. ابدأ بتعقيم ورقة بوليستر واحدة لكل قالب جل باستخدام autoclave. ثم، انقع شريحتين زجاجيتين وثلاث فواصل بلاستيكية لكل قالب جل في 70% ethanol لمدة ساعتين على الأقل.

بالإضافة إلى ذلك، قم بنقع خمسة مشابك تثبيت لكل قالب هلام في ethanol بتركيز 70% لمدة 10 دقائق. ضع الشرائح الزجاجية، والفواصل، ومشابك التثبيت على ورقة تعقيم صغيرة داخل غطاء زراعة الخلايا لتركها تجف في الهواء لعدة ساعات. بعد ذلك، قم بتجهيز قوالب الهيدروجيل عن طريق وضع الفواصل البلاستيكية بسماكة 0.5 millimeter حول حافة الشريحة الزجاجية.

ضع الشريحة الزجاجية الثانية في الأعلى، ثم ثبت الفواصل بإحكام بجانب بعضها البعض باستخدام مشابك الورق. وأخيراً، قم بتعقيم سطح القالب عن طريق وضعه في غطاء السلامة وتشغيل الأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام. وفي منتصف عملية التعقيم، اقلب القالب لضمان تعريض كلا السطحين للأشعة.

قم بتحضير محاليل السلائف الهلامية كما هو موضح في الجدول الأول من البروتوكول النصي المرفق. بعد ذلك، اخلط أحجام PEG-DA والفيبرونكتين والبادئ الضوئي معاً لتكوين الهيدروجيل. استخدم الماصة لخلط المحلول بقوة لضمان الحصول على محلول متجانس، مع تجنب تكوين فقاعات.

قم بنقل محلول السلائف الهلامي بعناية بواسطة الماصة بين الشريحتين الزجاجيتين لقالب الهلام. بعد ذلك، ضع القالب تحت ضوء Uv وعرّضه له لمدة تتراوح من دقيقة إلى دقيقتين لتشكيل الهيدروجيل. وبمجرد التجلط، قم بإزالة مشابك الربط وأزل الشريحة الزجاجية العلوية برفق عن طريق تطبيق ضغط متعاكس على الفواصل الجانبية.

بعد ذلك، يتم استخدام مخرزة خزعة (biopsy punch) ذات حجم مناسب لقص عينات الهيدروجيل. يتم ثقب عدة عينات من الهيدروجيل من المستطيل الهلامي لتعمل كعينات مكررة وعينات ضابطة. يتم تعقيم القناع الضوئي عن طريق نقعه في ethanol بتركيز 70% لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، اترك قناع الصورة ليجف في الهواء داخل غطاء زراعة الخلايا. ثم، قم بنقل واحد إلى اثنين ميكرولتر لكل سنتيمتر مربع من محلول بروتيني مُثيول (thiolated protein solution) إلى سطح كل قطعة من الهيدروجيل المقطوعة لغرض تشكيل الأنماط السطحية. ومن المهم توزيع المحلول البروتيني بالتساوي على سطح الهيدروجيل لضمان تثبيت البروتين بشكل منتظم.

ضع القناع الضوئي بعناية على سطح الهيدروجيل. اضغط برفق على القناع لإزالة أي فقاعات تتكون بين القناع وسطح الهيدروجيل. بعد ذلك، ضع الهيدروجيل تحت الأشعة فوق البنفسجية وعرّضه لجولة ثانية من الأشعة فوق البنفسجية لمدة تتراوح بين 30 إلى 60 ثانية.

اغسل الهيدروجيلات باستخدام PBS لإزالة أي مواد غير متفاعلة، ثم ضع كل هيدروجيل داخل صفيحة الآبار بحيث يكون سطح النمط موجهاً للأعلى. بعد ذلك، اغسل الجيلات طوال الليل في PBS عند 4 °C. قم بإزالة PBS من الآبار، ثم أضف 250 µL من وسط EGM2 الأساسي في كل بئر واحضن الجيلات لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق عند 37 °C.

خلال فترة الحضن، قم بهضم طبق من خلايا HUVECs شبه الملتئمة إلى معلق من الخلايا المفردة باستخدام التقنيات القياسية بواسطة التريبسين. ثم، قم بطرد مركزي لمعلق الخلايا وأزل السائل الطافي بعناية. أعد تعليق كتلة الخلايا في وسط EGM2 الأساسي بدون إضافة عوامل نمو، وأضف جزءاً من معلق الخلايا إلى مقياس كرات الدم (hemocytometer).

قم بعدّ الخلايا لتحديد التركيز. بعد ذلك، قم بتدوير الطبق الذي يحتوي على الهيدروجيلات عند 300 x G لمدة ثلاث دقائق، للتأكد من استقرار الهيدروجيلات في قاع البئر وعدم طفوها. ومن الضروري جداً ألا تكون الهيدروجيلات طافية داخل الآبار.

ستؤدي الهيدروجيلات العائمة إلى الحد من نجاح استزراع الخلايا وتسبب مشكلات في تصوير الهيدروجيل. قم بنقل 75,000 خلية لكل سنتيمتر مربع ببطء باستخدام الماصة إلى مركز سطح كل هيدروجيل لتجنب زعزعة استقرار الجيلات. بعد ذلك، ضع الطبق في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 °C.

على مدار عدة أيام، قم بإخراج الطبق بشكل دوري لمراقبة هجرة الخلايا استجابةً لنمط البروتين. استبدل 50% من الوسط الغذائي كل يومين إلى ثلاثة أيام. عند تشكيل الهيدروجيلات، يمكن استخدام تركيزات متنوعة من سلائف PEG-diacrylate للحصول على صلابة الركيزة المطلوبة.

يوضح الشكل هنا أن محلول PEG-DA بتركيز 20% يتوافق مع صلابة تزيد عن 100 kilopascals. ومن المهم أيضاً مراعاة كل من تركيز البادئ الضوئي ووقت التعرض للأشعة فوق البنفسجية (UV)، حيث إن زيادة أي من هذين المتغيرين ستؤدي إلى انخفاض النشاط الحيوي للجزيئات المرتبطة، والذي تم تمثيله هنا من خلال النشاط الحيوي لـ lysosome. ويعد تقليل التعرض للأشعة فوق البنفسجية أثناء تكوين الهيدروجيل أمراً بالغ الأهمية للحفاظ على مجموعات acrylate الوظيفية الحرة لتفاعلات تثبيت البروتين اللاحقة.

تصبح الهيدروجيلات التي تتعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة تزيد عن دقيقتين غير قادرة على تكوين أنماط بروتينية مثبتة والموضحة باللون الأحمر. بالإضافة إلى ذلك، كلما زاد التعرض للأشعة فوق البنفسجية في نمط البروتين، تزيد كمية البروتينات التي تتفاعل مع السطح. وعند تحضيرها بشكل صحيح، يمكن زراعة الخلايا على ركائز الهيدروجيل ذات الأنماط هذه للتحكم في سلوكها.

هنا، تم استزراع الخلايا البطانية بشكل منتظم على سطح هيدروجيل PEG ذو نمط VEGF. وبعد يومين من الاستزراع، لوحظ هجرة الخلايا البطانية نحو المناطق المكانية من الهيدروجيل التي تحتوي على VEGF المثبت. وبناءً على تطوير هذا البروتوكول، يمكن للباحثين استخدامه لتثبيت أي بروتين أو ببتيد لاستكشاف منصات نشطة بيولوجياً جديدة لأنظمة الخلايا في المختبر (in-vitro).

عند محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر تقليل تركيز البادئ الضوئي ووقت التعرض للأشعة فوق البنفسجية للحفاظ على النشاط البيولوجي للجزيئات المثبتة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية نمذجة البروتينات والببتيدات النشطة بيولوجياً على هيدروجيلات PEG، وزرع الخلايا بشكل متجانس على الهيدروجيلات ومراقبة الاستجابة الخلوية الناتجة.