طرق لزيادة حساسية عالية الدقة ذوبان واحدة النكليوتيد تعدد الأشكال التنميط الجيني في الملاريا
November 10th, 2015
في حين تحليل عالية الدقة ذوبان يوفر القدرة على التمييز بين الأشكال النووية المنفردة في عدد السكان غير متجانسة، ويمكن أليل متحولة التضخيم التحيز زيادة قدرتها على اكتشاف الأليلات الحالية بنسب منخفضة نسبيا ضمن العينة. يصف هذا البروتوكول التحسينات التي من شأنها تحسين حساسية التحليل ذوبان عالية الدقة.
العام من تجربة الذوبان عالية الدقة التالية هو زيادة حساسية الكشف عن الأليلات الطافرة الموجودة بتركيزات منخفضة مع عينات فردية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير الحمض النووي المستخرج أولا عن طريق تخفيف القالب إلى الأحجام والتركيزات اللازمة. الخطوة الثانية هي إعداد المقايسات بنسب غير متماثلة من التمهيدي الأمامي والعكسي لزيادة منتج مسبار القالب.
بعد تحضير التفاعلات ، يتم ضبط درجة حرارة التلدين بين درجات حرارة انصهار المسبار عند ربطها إما بالنوع البري أو القالب المتحور. الخطوة الأخيرة هي تحليل المنتجات المضخمة على منصة إدارة الموارد البشرية المناسبة. في نهاية المطاف ، يسمح تحيز تضخيم الأليل المتحور وتفاعل البوليميراز المتسلسل غير المتماثل القائم على المسبار باكتشاف أكثر حساسية لطفرة SNP الصعبة بتركيزات منخفضة موجودة في العينات.
هذه الحساسية المتزايدة مفيدة لمراقبة الطفرات في السكان. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الذوبان القياسي عالي الدقة أو التنميط الجيني tac man ، هي أنها تسمح بزيادة الحساسية للأليلات الموجودة بتركيزات منخفضة ، وتسمح أيضا بالتنميط الجيني ل SNPs الموجودة بالقرب من بعضها البعض في الجينوم. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لانتشار مقاومة الأدوية في طفيلي الملاريا.
يمكن تطبيقه أيضا على أنظمة أخرى مثل مراقبة أنواع الأمراض المعدية الأخرى مثل فيروس نقص المناعة البشرية أو الكشف عن متغيرات السرطان النادرة في مجموعة من الخلايا. وستكون كيتلين دورفي تشرح الإجراء. فني من مختبرنا.
يتم تحضير قوالب للذوبان عالي الدقة أو إدارة الموارد البشرية من عينات المتصورة المنجلية التي تم الحصول عليها مباشرة من دم المرضى المشاركين في دراسات المواقع الميدانية. يمكن تخزين العينات على ورق الترشيح أو في اختبارات الكشف السريع أو كما يمكن أيضا تكييف عينات خلايا الدم الحمراء المحببة لتنمو في المختبر. يمكن طلب بعض السلالات المختبرية القياسية للتحليل من أبحاث الملاريا ويمكن استخراج عينات مركز موارد الكاشف المرجعي من الدم الكامل أو خلايا الدم الحمراء أو ورق الترشيح ، أو استخدامها مباشرة من خلايا الدم الحمراء المحببة أو المزرعة للتضخيم المباشر من خلايا الدم الحمراء المحببة.
أولا تحديد فقرة خلايا الدم الحمراء باستخدام الفحص المجهري الرقيق بعد الإجراء من مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها. ثم يتم تخفيف خلايا الدم الحمراء التي تحتوي على فقرات أعلى من 0.5٪ من واحد إلى 400. في TE ، سيتم استخدام ثلاثة ميكرولترات من خلايا الدم الحمراء المخففة لكل تفاعل من خمسة إلى 10 ميكرولتر بسبب التباين الإيجابي والسلبي ، يجب دائما تضمين الضوابط في تحليلات إدارة الموارد البشرية.
قم بإعداد 10 بيكوجرام إلى 10 نانوجرام لكل ميكرولتر واحد من المخففات من البلازميد أو المعايير مع الأنماط الجينية التي تم التحقق منها من التسلسل كمتصيدون موجبين. استخدم الماء بدرجة PCR كعنصر تحكم سلبي بدون قالب لتفاعلات التضخيم. ابدأ هذا الإجراء بإعداد 10 × مخزون عمل من البادئات والمجسات.
ينطبق نفس البروتوكول على المقايسات التي تستخدم 96 لوحة بئر ، و 384 لوحة بئر ، وثمانية شرائط أنبوبية أو شعيرات دموية زجاجية. ولكن لغرض هذا العرض ، سيتم استخدام 96 لوحة آبار وشعيرات دموية زجاجية فقط. يوضح هذا الجدول تركيزات مخزون العمل الموصى بها 10 × بالإضافة إلى التركيزات النهائية للتنميط الجيني لإدارة الموارد البشرية القائم على المسبار المحظور.
تحضير مخاليط التفاعل لكل منها. حسنا ، أضف ميكرولتر واحد من كل من 10 × مخزون العمل ، والبرايمر والمجسات الأمامية والعكسية. من أربعة إلى خمسة ميكرولترات من HRM الرئيسي ، يمزج ميكرولتر واحد من القالب والماء من فئة PCR لحجم تفاعل إجمالي يبلغ 10 ميكرولترات.
افعل الشيء نفسه لكل شعرية زجاجية. قم بتغطية الألواح والشعيرات الدموية الزجاجية. استخدم أختام الألواح الضوئية للتضخيم القائم على الألواح والأغطية البلاستيكية للأنظمة القائمة على الشعيرات الدموية.
تأكد من اكتمال التغطية وأن الألواح والأغطية محكمة الغلق تماما وتثبيتها لمنع التبخر. أثناء التضخيم. قم بتدوير العينات لإزالة فقاعات الهواء.
تدور الألواح في جهاز طرد مركزي منضدية لمدة ثلاث دقائق عند 1 ، 800 مرة G.Spin الشعيرات الدموية الزجاجية في بيكو فوج لمدة 10 إلى 15 ثانية. ضع لوحة التفاعل والشعيرات الدموية الزجاجية في مسبار محظور قياسي أو بروتوكولات تضخيم MAAB لتشغيل التدوير الحراري. بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، انتقل إلى تحليل الذوبان من واجهة برنامج النظام.
قم بإذابة الصفيحة من 40 درجة مئوية إلى 80 درجة مئوية لإنتاج كل من قمم ذوبان المسبار والأمبليكون. الخطوة الأولى لتحليل الذوبان على الدراجة الخفيفة أربعة 80 هي التطبيع من المشتق السالب للمضان الطبيعي فيما يتعلق بعرض درجة الحرارة. حرك أشرطة التطبيع لإحاطة منطقة ذوبان المسبار.
منطقة ذوبان المسبار هي درجة الحرارة المنخفضة لمنطقتي الذوبان. يجب أن تكون قضبان التطبيع في قاعدة قمم الذوبان. بعد التسوية، حدد حساب المجموعات لتعيين العينات تلقائيا للمجموعات إذا لزم الأمر، وأعد تعيين العينات يدويا لمجموعات معينة.
حدد العينات التي لم تتضخيم أو التي تحتوي على قمم ذوبان خشنة. ثم انتقل إلى مكالمة جديدة وحدد سلبي. بعد تحديد أي عينات متبقية غير مصنفة بشكل خاطئ ، انتقل إلى مكالمة جديدة ، وحدد التجميع المناسب وانقر فوق تطبيق تغيير تعيين الأنماط الجينية لكل مجموعة بناء على المعايير.
بعد التأكد من صحة المجموعات المحسوبة ، حدد تحرير أسماء المجموعات ضمن علامة تبويب التجميع. أدخل الأنماط الجينية للمعايير في المربع الملون المقابل. على سبيل المثال ، إذا كان المعيار 3D 7 يحتوي على نمط وراثي C معروف وكان في المجموعة الأولى ، فإن جميع العينات في المجموعة الأولى لها نتائج ضغط النمط الجيني C ويتم عرض الأنماط الجينية بجانب العينات.
أخيرا ، قم بتصدير النتائج كملف TXT لمزيد من تحليل العينة السكانية. بعد انتهاء التشغيل على الدراجة الخفيفة 2.0 ، قم بتسجيل أسماء العينات ومواضعها ضمن بيانات العينة قبل بدء التحليل ، قم بتسمية الضوابط السلبية والأنماط الجينية لمعايير الذوبان. ابدأ تحليل الذوبان عن طريق اختيار التحليل واختيار التنميط الجيني تحت تحليل منحنى الذوبان والضغط. حسنًا.
لزيادة حساسية التجميع التلقائي، حدد جميع العينات بحيث يتم رسم الشاشة في منحنيات الذوبان. حرك شريط التطبيع إلى الحد العلوي لقمم ذوبان المسبار. تأكد من تجميع العينات بشكل صحيح عن طريق تحديد كل مجموعة بشكل فردي أسفل اسم المجموعة.
قم بتصدير الأنماط الجينية لكل عينة عن طريق تحديد جميع العينات ونسخ البيانات ولصقها في ورقة عمل. عادة ما تكون مخطط المشتق السالب للتألق الطبيعي فيما يتعلق بدرجة الحرارة هي الطريقة الأكثر مباشرة لتصور قمم الانصهار وتحديد الأنماط الجينية. يؤدي ضبط نافذة التحليل على منطقة مسبار فقط إلى تمايز واضح للقمم المقابلة لعدد الأشكال المحدد.
تؤدي التطابقات المثالية إلى قمم ذوبان أعلى مشار إليها باللون الأحمر. في حين أن عدم تطابق SNP له درجات حرارة انصهار أقل موضحة باللون الرمادي عندما يكون كلا الأليلين موجودين في العينة. يمثل تحليل إدارة الموارد البشرية القائم على Prob كلا الأليلين كمنحنيين ذروتين موضحين باللون البرتقالي مع قمم تتطابق مع عينات الأليل المفردة الموضحة باللونين الأحمر والرمادي ، مما يقلل تدريجيا من درجة حرارة النفايات أثناء التضخيم يؤدي إلى تحيز تجاه الأليل المتحور الذي يمثله الذروة الجانبية اليسرى في عينة متعددة الجينوم أو متعددة الأليل.
ينتج عن تحيز تضخيم الأليل المتحور هذا حساسية إدارة الموارد البشرية للكشف عن الأليلات الثانوية الموجودة في أقل من 1٪ في عينات متعددة الجينوم أو متعددة الأليلات. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن جودة العينة هي المفتاح. يمكن أن تؤدي الاختلافات الطفيفة في تركيزات المخزن المؤقت إلى تغيير منحنيات إدارة الموارد البشرية.
يعد استخدام عناصر التحكم طريقة مفيدة لتوحيد النتائج. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المتماثل القائم على الاختبار وتحيز تضخيم الأليل الطافرة لتكوين تعدد الأشكال للملاريا بدقة وحساسية من مجموعة متنوعة من أنواع العينات.
الموجز
يعزز هذا البروتوكول حساسية تحليل الذوبان ذو الدقة العالية (HRM) لكشف الأليلات الطافرة بتركيزات منخفضة. من خلال تحسين إعداد الحمض النووي وظروف المقايسة، فإنه يسمح بتحسين اكتشاف طفرات SNP الصعبة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الوراثة
- علم الأحياء الجزيئية
- مراقبة العوامل الممرضة
الخلفية
- تحليل الذوبان ذو الدقة العالية يفرق بين تعدد الأشكال النووية المفردة (SNPs).
- يمكن أن يعزز تحيز تضخيم الأليلات الطافرة من حساسية الكشف.
- مفيد لمراقبة الطفرات في السكان، بما في ذلك مقاومة الأدوية.
- قابل للتطبيق على مختلف الأمراض المعدية ومتغيرات السرطان.
هدف الدراسة
- زيادة الحساسية في اكتشاف الأليلات الطافرة ذات التركيز المنخفض.
- تحسين تحديد النمط الجيني للأليلات القريبة الموقع.
- توفير طريقة موثوقة لمراقبة الطفرات.
الطرق المستخدمة
- إعداد الحمض النووي المستخلص من عينات المرضى.
- نسب بادئات غير متماثلة لتعزيز التضخيم.
- الدورة الحرارية وتحليل الذوبان باستخدام منصات HRM.
- إدراج ضوابط إيجابية وسلبية في التحليلات.
النتائج الرئيسية
- تحسين الكشف عن طفرات SNP بتركيزات منخفضة.
- تطبيق ناجح في مراقبة مقاومة الأدوية في الملاريا.
- الفعالية المثبتة في أنواع مختلفة من العينات.
- يمكن تصدير النتائج لمزيد من التحليل.
الاستنتاجات
- تحسن الطريقة بشكل كبير الحساسية مقارنة بـ HRM القياسي.
- إنها متعددة الاستخدامات لتطبيقات مختلفة في مراقبة الأمراض.
- توفر إطارًا قويًا للدراسات الجينية المستقبلية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Enhanced sensitivity in SNP genotyping supports early detection of low-frequency drug-resistant malaria strains, a critical need for surveillance in elimination settings. The method enables reliable genotyping of polygenomic infections, improving the accuracy of resistance marker tracking and parasite population fingerprinting. This capability strengthens predictive confidence in resistance emergence and informs timely public health interventions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting minor allele variants associated with drug resistance.
- Operational Value: Supports functional target validation through sensitive SNP discrimination in complex genomic backgrounds.
- Predictive Value: Increases confidence in lead identification by reducing false negatives in low-abundance mutation detection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by ensuring accurate SNP genotyping.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through asymmetric primer optimization and melting curve normalization.
- Scalability: Compatible with 96-well plates, 384-well plates, and capillary systems for high-throughput surveillance workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling consistent SNP monitoring across sample types.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in resistance mechanism attribution by improving detection of minor allele variants.
- Disease-Relevant System: Applicable to Plasmodium falciparum field samples, supporting real-world surveillance relevance.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early SNP detection to lead optimization and preclinical validation, particularly for resistance mechanism studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling sensitive detection of resistance-associated SNPs.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through normalized melting peak analysis and group calling.
- Analytics: Provides statistical confidence via group reassignment and genotype calling based on melting curve clustering.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling longitudinal tracking of allele frequency shifts in parasite populations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genotyping platform adaptable to other infectious diseases and cancer variant surveillance.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in resistance detection.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across sample types and platforms.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions in resistance monitoring, capital efficiency in surveillance programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of interventions based on early detection of emerging resistance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in PCR optimization, melting curve analysis, and genotype calling.
- Dependent on HRM-capable thermal cyclers and normalized fluorescence analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of primer ratios, annealing temperatures, and normalization protocols.
- Adaptation across model systems requires validation of asymmetric PCR conditions for each target SNP.
- Practical limitations include sensitivity to buffer quality and the need for proper negative controls to prevent false positives.
