العزلة والكمي لالبوتولينوم السموم العصبية من مصفوفات مجمع باستخدام مصفوفة BoTest فحوصات

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس النشاط التحليلي للبروتين لسموم البوتولينوم العصبية في المصفوفات المعقدة مثل العينات الصيدلانية والبيئية والغذائية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق معالجة عينات الاختبار وعينات المنحنى القياسي عند الضرورة، لتهيئة ظروف مناسبة من حيث الرقم الهيدروجيني pH واللزوجة. بعد ذلك، يتم ترسيب السموم العصبية للبوتولينوم مناعياً من العينات باستخدام حبيبات مغناطيسية مغلفة بالأجسام المضادة.

بعد ذلك، يتم غسل الخرزات المغناطيسية جيداً لإزالة أي مركبات متداخلة وإعادة تعليقها في منظم تفاعل مُحسَّن. وأخيراً، تُحضن الخرزات المغسولة مع بروتين كاشف ويُقاس انقسام الكاشف طيفياً بمرور الوقت. وفي النهاية، تُستخدم مقارنة انقسام الكاشف في عينات الاختبار مقابل عينات المنحنى القياسي لتقدير نشاط سم البوتولينوم في عينات الاختبار بحساسية تقارب حساسية المقايسة الحيوية باستخدام الفئران.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى، مثل المقايسات الحيوية باستخدام الفئران والمقايسات المناعية والطرق الفلورية الأخرى، في أن هذا المقايسة لا تتطلب استخدام الحيوانات، وقد ثبتت فعاليتها للاستخدام في المصفوفات شديدة التعقيد الموجودة في العينات الغذائية والبيئية والصيدلانية. وبوجه عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات نظراً للحاجة إلى معالجة وتخفيف دقيقين للعينات. سيقوم بشرح هذا الإجراء الدكتور Mark Dunning، وهو عالم في Bio Sentinel.

قم بتحضير المحاليل المنظمة وفقاً للبروتوكول النصي لإنشاء منحنى قياسي لتقدير كمية عينات الاختبار، زن 10 ± 0.01 جرام من عينة طعام صلبة في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر واترك هذه العينة جانباً حيث ستُستخدم كمحلول تخفيف، في أنبوب ثانٍ زن 2 ± 0.01 جرام من عينة طعام صلبة. أضف سموم البوتولينيوم العصبية أو BoNT إلى سطح عينة الطعام التي تزن جرامين للوصول إلى تركيز نهائي قدره 30,000 MLD₅₀ لكل جرام من الطعام. قم بحضن عينة محلول التخفيف والعينات المطعمة في درجة حرارة الغرفة أو عند 4 درجة مئوية لمدة ساعتين لإعطاء BoNT الوقت الكافي للتفاعل مع مصفوفة الطعام.

لمحاكاة التلوث الطبيعي، يرجى الرجوع إلى البروتوكول النصي لمعرفة أنواع العينات الإضافية. بعد ذلك، أضف 1 mL من GPB لكل جرام من الطعام إلى العينات الملقحة وغير الملقحة، واستخدم مدقة للمجانسة حتى يتم المزج تماماً. استنبط الحجم الإجمالي لعينة الجرامين الملقحة من الحجم الإجمالي التقريبي لعينة المخفف المكونة من 10 جرام.

ثم أضف حجماً يعادل 1/10 من محلول منظم التعادل بتركيز 10x إلى عينة المخفف بوزن 10 جرام، وإلى عينة مدعمة بوزن جرامين، بناءً على أحجامهما الإجمالية. اخلط العينات جيداً عن طريق القلب، ثم قم بتصفية كلتا العينتين جزئياً بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 6,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، قم بإزالة السوائل الطافية فوراً وانقلها إلى أنابيب جديدة، مع اعتبار العينة المدعمة كـ D1 والعينة غير المدعمة كمخفف، ثم قم بتحضير بقية عينات منحنى القياس في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر.

لتحضير عينات الطعام الصلبة، ابدأ بوزن 2 ± 0.01 غرام من عينة صلبة مجهولة في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر. أضف 2 ملليلتر من GPB واستخدم مدقة لتجانس العينة. بعد ذلك، أضف إلى العينة حجماً يعادل عُشر حجم العينة من محلول neutralization buffer بتركيز 10x، وامزج جيداً عن طريق القلب. بعد ترويق العينة جزئياً عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 6,000 ×g ودرجة حرارة 4 درجة مئوية، انقل فوراً 750 ميكرولتر على الأقل من السائل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق.

هذا هو التخفيف المجهول الأول. أضف 675 µL من المخفف إلى أنبوبين تم وضع علامة "التخفيف المجهول الثاني" و"الثالث" عليهما. سيكون المخفف هو نفس المادة المعالجة المستخدمة لإنشاء المنحنى القياسي.

استخدم التخفيف الأول لإجراء تخفيف تسلسلي عن طريق نقل 75 µL من التخفيف الأول إلى أنبوب التخفيف الثاني والخلط. ثم انقل 75 µL من التخفيف الثاني إلى أنبوب التخفيف الثالث واخلط. لتصفية العينات، قم بطردها مركزياً لمدة خمس دقائق عند 14,000 ×g على الأقل.

قم بإزالة السوائل الطافية فوراً وانقلها إلى أنابيب جديدة لتجهيز لوحة العينات، ثم أضف 20 µL من منظم الربط (binding buffer) بتركيز 10x إلى كل بئر؛ وتتطلب كل عينة مجهولة وعينات المنحنى القياسي من D1 إلى D8 ثلاثة آبار، بينما تتطلب العينة D9 ستة آبار. أضف 200 µL من كل عينة إلى الآبار المخصصة لها واستخدم خلاط الأطباق الدقيقة (microplate mixer) لخلط اللوحة لمدة 10 ثوانٍ. قم برج حبيبات IPA باستخدام جهاز الفورتيكس (vortex) لمدة 10 ثوانٍ بأقصى سرعة أو حتى يتم إعادة تعليقها بالكامل.

بعد ذلك، يتم نقل 20 µL من الحبيبات إلى كل بئر من آبار العينات باستخدام الماصة، وتُخلط الصفيحة لمدة 30 ثانية. تُحضن الصفيحة في محضنة صفائح دوارة لمدة ساعتين بسرعة 750 RPM وعند درجة حرارة 25 °C أو في درجة حرارة الغرفة، لغسل الصفيحة باستخدام غسالة صفائح آلية. بعد تشغيل برنامج التحضير (prime program)، تُوضع الصفيحة على صفيحة فصل الحبيبات المغناطيسية ذات الـ 96 بئراً الموجودة في غسالة الصفائح.

ثم قم بتشغيل برنامج الغسل الرئيسي. وعند اكتمال البرنامج، أخرج الطبق من جهاز الغسل. أضف 50 µL من محلول التفاعل المنظم بتركيز 1x إلى كل بئر من آبار العينات واخلط لمدة 30 ثانية.

لبدء مقايسة مصفوفة اختبار البوت، أضف 50 µL من مراسل AE بتركيز 0.5 µM إلى كل بئر من آبار العينات. ولمنع تأثيرات الحواف، أضف 100 µL من الماء إلى كل بئر غير مستخدم. استخدم شريط الإغلاق لإحكام غلق الطبق، واحمه من الضوء ثم قم بتحضينه عند 750 RPM و25 °C أو في درجة حرارة الغرفة.

عند كل وقت قراءة، أخرج الطبق من الحاضنة. قم بإزالة الشريط اللاصق العلوي، وضع الطبق فوراً على طبق فصل الحبيبات المغناطيسية ذو الـ 96 بئراً، واترك الحبيبات تنفصل لمدة دقيقتين. ضع الطبق في قارئ الأطباق الدقيقة وقم بقياس الانبعاثات عند حوالي 470 وحوالي 526 nanometers تحت إثارة عند حوالي 434 nanometers.

إذا كانت هناك رغبة في الحصول على أوقات قراءة إضافية، فبعد إعادة تعليق الخرزات لمدة 30 ثانية على جهاز خلط الأطباق الدقيقة، أعد إغلاق الطبق بإحكام وأعده إلى الحاضنة. تظهر هنا نتائج المقايسة باستخدام bot holo toin المضاف إلى PBS والذي تم اختباره بعد فترات تحضين لمدة ساعتين وأربع ساعات و24 ساعة مع AE reporter. يُقاس انقسام reporter بواسطة bot على أنه انخفاض في نسبة الانبعاث المقاسة بواسطة قارئ الأطباق الخاص بنا، من حوالي 2.7 للـ reporter السليم إلى حوالي 0.7 للـ reporter المنقسم تماماً.

ستختلف القيم المحددة بين أجهزة قراءة الأطباق كما يتضح من الإزاحة نحو اليسار في المنحنى، ويؤدي إطالة وقت تحضين البروتين المراسل إلى زيادة انقسام هذا البروتين. وتظهر نقاط البيانات التي تم اختبارها في ثلاث مكررات انحرافًا معياريًا منخفضًا للمتوسط، وتتبع الاتجاه المتوقع بزيادة نسبة الانبعاث مع انخفاض حمولة الذيفان. وقد يشير فشل المقايسة في اتباع هذا الاتجاه المتوقع إلى حدوث خطأ أثناء عملية التخفيف أو رسم البيانات، كما تظل نسب الانبعاث للعينات الضابطة التي لا تحتوي على bot A ثابتة أثناء التحضين، مما يشير إلى عدم وجود نشاط لبروتياز غير محدد.

يوضح هذا الشكل المنهجية العامة المستخدمة للكشف عن أي عينة مجهولة أو تقدير كميتها مقارنة بمنحنى قياسي، ويقوم بتقدير كمية عينات bot a الدوائية. تم إنشاء منحنى قياسي في محلول PBS باستخدام bot منقى، وهو holo toin، وتمت معالجته بالتوازي مع تخفيفات للمنتج الدوائي المُعد من فيال واحدة سعة 100 وحدة من Botox المجفف بالتجميد والذي تمت إعادة ترطيبه بمحلول ملحي بتركيز 0.9%. في هذا المقايسة، يقع الجزء الخطي من المنحنى القياسي بين نسبة انبعاث تبلغ 2.11 و 1.05، ويُشار إليه بالمربع المتقطع في الشكل. ثم تم استقراء تركيزات العينات الثلاث المجهولة التي تقع ضمن هذا النطاق الخطي من المنحنى القياسي.

في هذه التجربة، استُخدمت ثمار الطماطم الطازجة والحليب بنسبة 2% كقوالب غذائية صلبة وسائلة، وتم تدعيمها بـ bot، وهو مركب يتكون من البروتينات المرتبطة باللب المجوف، و toin، والسم العصبي. وقد اختير هذا المزيج لأنه يشبه السم الناتج أثناء التلوث الطبيعي بـ clostridium كما هو موضح هنا. وقد لوحظ استعادة bot A في كلا القالبين.

علاوة على ذلك، فإن زيادة وقت الحضن مع الكاشف تزيد من حساسية المقايسة ولكنها لا تؤدي إلى انخفاض نسب الانبعاث في عينات الضبط الخالية من السموم، مما يشير إلى أن التحلل الملحوظ ناتج عن bot A وليس عن انتقال بروتياز غير متخصص من الغذاء في المقايسة. تم تلخيص bot A-L-O-D-L-O-Q و EC 50 لكلا الغذاءين عند كل نقطة زمنية موضحة في هذا الجدول. وتُعرَّف LOD و LOQ على أنهما تركيز العينة الأدنى الذي تكون نسبة الانبعاث فيه أقل من ثلاثة انحرافات معيارية و 10 انحرافات معيارية تحت مستوى الخلفية على التوالي.

من المتوقع حدوث بعض التباين بين مصفوفة وأخرى في حد الكشف (LOD) وحد التحديد الكمي (LOQ)، حيث قد تؤثر تأثيرات المصفوفة على ارتباط السم بالخرزات واستعادة الخرزات أثناء عملية الغسل. وبينما يبدو من البيانات أن استعادة السم من الحليب بنسبة 2% كانت أعلى منها في الطماطم، فإن جزءاً كبيراً من هذا الفرق ناتج عن التخفيف الإضافي المطلوب لمجانسة عينات الطماطم في GPB. وبالإضافة إلى كونها مصفوفة غذائية صلبة، تعد الطماطم نوعاً من العينات التي يكون فيها ضبط pH والقوة الأيونية أمراً حاسماً لنجاح المقايسة.

يوضح هذا الشكل استجابات المقايسة عند اختبار الطماطم مع أو بدون إضافة محلول معادلة تركيز 10x. يؤدي عدم إضافة المحلول المنظم إلى ضعف استعادة سم البوتولينوم A (bot A) من العينات، وهو ما يظهر من خلال نسبة انبعاث ثابتة عبر جميع تركيزات bot A المختبرة؛ ومع ذلك، تؤدي إضافة محلول معادلة تركيز 10x إلى كشف حساس للسم. قد تكون البروتيازات غير النوعية داخلية في عينة الطعام أو يتم إدخالها عند استخدام تحضيرات bot غير منقاة مثل مستنبتات Clostridium وسوائلها الطافية، وقد تعمل على شطر المراسل AE مما يؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة. يوضح هذا المثال نشاط البروتياز غير النوعي الموجود في السوائل الطافية لمستنبت Clostridium bot a باستخدام مراسل معدل لم يعد قابلاً للشطر بواسطة bot A. تشير المستويات العالية من شطر المراسل إلى المستنبت.

يحتوي السائل الطافي على نشاط بروتياز ملحوظ، والذي يمكن إبطاله بفعالية عن طريق إضافة مثبطات البروتياز. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون فترة زمنية تتراوح بين 4 و26 ساعة من إجمالي وقت المقايسة، اعتماداً على نوع العينة والحمل السمي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لديك فهم جيد لكيفية عزل وتقدير كمية سم البوتولينوم العصبي من العينات المعقدة باستخدام الترسيب المناعي في نظام تقرير بروتيني قائم على الفلورة.

لا تنسَ أن العمل مع سموم البوتولينوم العصبية يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب استخدام تدابير وقائية مثل القفازات، ومعاطف المختبر، وكبائن السلامة الكيميائية والبيولوجية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.