العزلة والكمي لالبوتولينوم السموم العصبية من مصفوفات مجمع باستخدام مصفوفة BoTest فحوصات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد النشاط المحلل للبروتين للسموم العصبية للبوتولينوم في المصفوفات المعقدة مثل العينات الصيدلانية والبيئية والغذائية. يتم تحقيق ذلك عن طريق اختبار المعالجة الأول وعينات المنحنى القياسية إذا لزم الأمر ، لتهيئة ظروف مناسبة لدرجة الحموضة واللزوجة. بعد ذلك ، يتم ترسيب السم العصبي للبوتولينوم مناعيا من العينات باستخدام حبات مغناطيسية مغلفة بالأجسام المضادة.

ثم يتم غسل الخرزات المغناطيسية جيدا لإزالة أي مركبات متداخلة وإعادة تعليقها في مخزن مؤقت محسن للتفاعل. أخيرا ، يتم تحضين الخرزات المغسولة بمراسل بروتين وتقيس انقسام المراسل طيفيا بمرور الوقت. في النهاية ، يتم استخدام مقارنة انقسام المراسل في عينات الاختبار مقابل عينات المنحنى القياسية لتحديد نشاط توكسين البوتولينوم في عينات الاختبار مع حساسية الماوس إلى المقايسة الحيوية القريبة من الفأر.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى مثل الماوس والمقايسة الحيوية والمناعة وطرق الفلورسنت الأخرى في أن هذا الاختبار لا يتطلب استخدام وقد ثبت استخدامه في المصفوفات المعقدة للغاية الموجودة في العينات الغذائية والبيئية والصيدلانية. بشكل عام ، قد يعاني الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب الحاجة إلى معالجة العينات وتخفيفها بعناية. سيوضح هذا الإجراء الدكتور مارك دانينج ، العالم في Bio Sentinel.

قم بإعداد المخازن المؤقتة وفقا لبروتوكول النص لإنشاء منحنى قياسي لقياس عينات الاختبار ، وقم بوزن 10 زائد أو ناقص 0.01 جرام من عينة الطعام الصلبة في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر ووضعه جانبا سيتم استخدام هذه العينة حيث أن المخفف في الأنبوب الثاني يزن اثنين زائد أو ناقص 0.01 جرام من عينة الطعام الصلبة. أضف السم العصبي للبوتولينوم أو تم شراؤه على سطح عينة الطعام التي يبلغ وزنها جراما إلى تركيز نهائي قدره 30،000 MLD 50 لكل جرام من الطعام. احتضان العينات المخففة والمسننة في درجة حرارة الغرفة أو أربع درجات مئوية لمدة ساعتين لمنح الروبوت وقتا للتفاعل مع مصفوفة الطعام.

لمحاكاة التلوث الطبيعي ، راجع بروتوكول النص للحصول على أنواع عينات إضافية. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من GPB لكل جرام من الطعام إلى العينات المسننة وغير المسننة ، واستخدم مدقة للتجانس حتى تمتزج جيدا. استقراء الحجم الإجمالي للروبوت الذي يبلغ وزنه جرامين عينة مسننة من الحجم الإجمالي التقريبي للعينة المخففة 10 جرام.

ثم أضف حجما واحدا 10 من 10 × مخزن مؤقت للتحييد إلى عينة المخففة 10 جرام واشترى جرامان عينة مسننة بناء على أحجامها الإجمالية. العينات المختلطة جيدا عن طريق الانعكاس ، وتوضيح كلتا العينتين جزئيا عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 6 ، 000 مرة من الجاذبية وأربع درجات مئوية. ثم قم بإزالة المواد الطافية على الفور ونقلها إلى أنابيب جديدة باستخدام الروبوت ، وهي عينة مسننة مثل D واحد ، وتولد العينة غير المسننة كمخفف عينات المنحنى القياسية المتبقية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر.

لتحضير عينات الطعام الصلب ، ابدأ بوزن اثنين زائد أو ناقص 0.01 جرام من العينة الصلبة غير المعروفة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. أضف ملليلترين من GPB واستخدم مدقة لتجانس العينة. بعد ذلك ، أضف واحدا من 10 من حجم 10 × المخزن المؤقت للتحييد إلى العينة واخلطه جيدا عن طريق الانعكاس بعد توضيح العينة جزئيا عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 6،000 مرة من الجاذبية وأربع درجات مئوية تنقل على الفور ما لا يقل عن 750 ميكرولترا من المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي صغير.

هذا هو التخفيف غير المعروف. أضف 675 ميكرولترا من المخفف إلى أنبوبين يحملان اسم التخفيف غير المعروف الثاني والثالث. سيكون المخفف هو نفس المادة المعالجة المستخدمة في توليد المنحنى القياسي.

استخدم التخفيف الأول لعمل التخفيف التسلسلي عن طريق نقل 75 ميكرولترا من التخفيف ، أحدهما إلى التخفيف ، والأنبوب الثاني ، والخلط. ثم انقل 75 ميكرولترا من التخفيف اثنين إلى الأنبوب الثلاثة المخفف واخلطه. لتوضيح العينات ، قم بطردها المركزي لمدة خمس دقائق على الأقل 14 ، 000 مرة. جاذبية.

قم بإزالة المواد الطافية على الفور ونقلها إلى أنابيب جديدة لإعداد صفيحة للعينات ، وأضف 20 ميكرولترا من 10 × مخزن مؤقت ملزم لكل بئر كل عينة غير معروفة والعينات المنحنية القياسية D من واحد إلى D ثمانية تتطلب ثلاثة آبار وتتطلب العينة D تسعة ستة آبار. أضف 200 ميكرولتر من كل عينة إلى الآبار المعنية واستخدم خلاط صفيحة دقيقة لخلط اللوحة لمدة 10 ثوان. دوامة حبات IPA لمدة 10 ثوان بأعلى سرعة أو حتى يتم تعليقها بالكامل.

ثم ماصة 20 ميكرولترا من الخرزات في كل عينة جيدا واخلط اللوحة لمدة 30 ثانية. احتضان اللوحة في حاضنة لوحة دوارة لمدة ساعتين عند 750 دورة في الدقيقة و 25 درجة مئوية أو درجة حرارة الغرفة لغسل اللوحة باستخدام غسالة الألواح الآلية. بعد تشغيل البرنامج الرئيسي ، ضع اللوحة على لوحة فصل الخرزة المغناطيسية 96 جيدا على غسالة اللوحة.

ثم قم بتشغيل برنامج الغسيل الرئيسي. عند اكتمال البرنامج ، قم بإزالة اللوحة من الغسالة. أضف 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتفاعل x إلى كل عينة جيدا واخلطها لمدة 30 ثانية.

لبدء مقايسة مصفوفة اختبار الروبوت ، أضف 50 ميكرولترا من مرسل AE 0.5 ميكرومولار. إلى كل عينة بئر لمنع تأثيرات الحواف ، أضف 100 ميكرولتر من الماء إلى كل بئر غير مستخدم. استخدم شريط السقف جيدا لإغلاق اللوحة وحمايتها من الضوء واحتضانها عند 750 دورة في الدقيقة و 25 درجة مئوية أو درجة حرارة الغرفة.

في كل وقت قراءة ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة. قم بإزالة شريط السقف ، وضع اللوحة على الفور على لوحة فصل الخرزة المغناطيسية 96 جيدا ، اترك الخرزات تنفصل لمدة دقيقتين. ضع اللوحة في قارئ الصفيحة الدقيقة وقم بقياس الانبعاثات عند حوالي 470 وحوالي 526 نانومتر تحت الإثارة عند حوالي 434 نانومتر.

إذا كانت هناك حاجة إلى أوقات قراءة إضافية ، بعد تعليق الخرز لمدة 30 ثانية على خلاط الصفيحة الدقيقة ، أعد إغلاق اللوحة وإعادتها إلى الحاضنة. تظهر هنا نتائج الفحص باستخدام الروبوت ، ارتفع holo toin إلى PBS وتم اختباره بعد حضانات لمدة ساعتين وأربع و 24 ساعة مع مراسل AE. يتم قياس انقسام المراسل بواسطة الروبوت على أنه انخفاض في نسبة الانبعاث التي يقيسها قارئ اللوحة لدينا على أنها حوالي 2.7 للمراسل السليم إلى حوالي 0.7 للمراسل المشقوق بالكامل.

ستختلف القيم المحددة بين قارئات اللوحات كما يتضح من التحول إلى اليسار في المنحنى ، ويؤدي وقت الحضانة المطول مع المراسل إلى زيادة انقسام المراسل. تظهر نقاط البيانات المختبرة في ثلاث نسخ انحرافا معياريا منخفضا للمتوسط وتتبع الاتجاه المتوقع لزيادة نسبة الانبعاثات مع انخفاض حمل السم. قد يشير فشل الاختبار في اتباع هذا الاتجاه المتوقع إلى وجود خطأ أثناء توليد التخفيف أو أن البيانات التي ترسم نسب انبعاث الضوابط التي لا تحتوي على بوت A تظل ثابتة أيضا أثناء الحضانة مما يشير إلى عدم وجود نشاط بروتياز غير محدد.

يوضح هذا الشكل المنهجية العامة المستخدمة لاكتشاف أو تحديد أي عينة غير معروفة مقابل منحنى قياسي ويحدد عينات البوت الصيدلاني أ. تم إنشاء منحنى قياسي في PBS باستخدام روبوت منقى ، وهو هولو توين ومعالجته بالتوازي مع تخفيفات منتج الدواء الناتج عن قارورة واحدة سعة 100 وحدة من البوتوكس المجفف بالتجميد المعاد ترطيبه في محلول ملحي بنسبة 0.9٪ في هذا الفحص ، يقع الجزء الخطي من المنحنى القياسي بين نسبة انبعاث 2.11 و 1.05 ، ويشار إليه بالمربع المتقطع في الشكل. ثم تم استيفاء تركيزات المجهول الثلاثة التي تقع ضمن هذا النطاق الخطي من المنحنى القياسي.

في هذه التجربة ، تم استخدام الطماطم الطازجة و 2٪ من الحليب كمصفوفات غذائية صلبة وسائلة وتم تركيبها باستخدام الروبوت وهو مركب يتكون من البروتينات المرتبطة بالهولو والتوين والسموم العصبية. تم اختيار هذا المزيج لأنه يشبه السم الناتج أثناء تلوث المطثية الطبيعي كما هو موضح هنا. لوحظ استرداد الروبوت أ مع كلا المصفوفات.

علاوة على ذلك ، فإن زيادة وقت الحضانة مع المبلغ يزيد من حساسية الفحص ولكنها لا تؤدي إلى انخفاض نسب الانبعاث لضوابط عدم وجود سموم مما يشير إلى نتائج الانقسام المرصودة من الروبوت A وليس انتقال البروتياز غير المحدد من الطعام في الفحص. يتم تلخيص الروبوت A-L-O-D-L-O-Q و EC 50 لكلا الأطعمة في كل نقطة زمنية معروضة في هذا الجدول. ويعرف LOD وLOQ بأنهما عينة تركيز أقل بنسبة انبعاث أقل من ثلاثة و10 انحرافات معيارية تحت الخلفية على التوالي.

من المتوقع أن تؤثر بعض المصفوفة إلى تباين المصفوفة في LOD و LOQ حيث قد تؤثر تأثيرات المصفوفة على ارتباط السم بالخرز واستعادة الخرز أثناء الغسيل. في حين أنه يبدو أن هناك المزيد من استعادة السموم من 2٪ حليب من الطماطم من البيانات ، فإن الكثير من هذا الاختلاف ناتج عن التخفيف الإضافي المطلوب لتجانس عينات الطماطم في GPB. بالإضافة إلى كونها مصفوفة غذائية صلبة ، تعد الطماطم نوعا من العينات الجديرة بالملاحظة حيث يعد تعديل الأس الهيدروجيني والقوة الأيونية أمرا بالغ الأهمية لنجاح الفحص.

هذا الشكل استجابات الفحص عند اختبار الطماطم مع أو بدون تضمين المخزن المؤقت للتحييد 10 ×. يؤدي الفشل في إضافة المخزن المؤقت إلى ضعف استرداد الروبوت A من العينات ويتم توضيحه من خلال نسبة انبعاث ثابتة عبر جميع تركيزات الروبوت A المختبرة لمخزن 10 × تحييد ، ومع ذلك ، يؤدي إلى اكتشاف السموم الحساسة ، وقد تكون البروتياز غير المحددة داخلية في عينة الطعام أو يتم إدخالها عند استخدام مستحضرات الروبوت غير المنقاة مثل ثقافة المطثية ، المواد الطافية ، وقد تشق مراسل AE مما يؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة. يوضح هذا المثال نشاط البروتياز غير المحدد الموجود في Clostridium bot ، وهو عبارة عن طافي ثقافة يستخدم مراسلا معدلا لم يعد مقطوعا بواسطة الروبوت A. تشير المستويات العالية من انقسام المراسل إلى الثقافة.

المطحون الطافي على نشاط كبير للبروتياز ، والذي يتم إبطاله بشكل فعال عن طريق إضافة مثبطات الإنزيم البروتيني. بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في ما بين أربع و 26 ساعة من إجمالي وقت الفحص ، اعتمادا على نوع العينة وحمل السم. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل وقياس السم العصبي للبوتولينوم من العينات المعقدة باستخدام الترسيب المناعي في نظام مراسل البروتين القائم على الفلورة.

لا تنس أن العمل مع السموم العصبية للبوتولينوم يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب استخدام الاحتياطات مثل القفازات ورموز المختبرات وخزانات السلامة الكيميائية والبيولوجية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.