A منصة القائم على الحنق عالية الإنتاجية التي تتلاءم مع تحديد وتوصيف البوتولينوم السموم العصبية ضوء سلسلة المغيرون

الهدف العام من هذا الإجراء هو فحص الجزيئات الصغيرة بحثا عن السموم العصبية للبوتولينوم ، وهو تثبيط للسلسلة الخفيفة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير سلسلة التخفيف المركب أولا بدقة ودقة عالية. الخطوة الثانية هي نقل التخفيفات المركبة إلى صفيحة سوداء 96 بئر.

بعد ذلك ، يضاف إنزيم السلسلة الخفيفة المخفف إلى اللوحة ويتم تحضين الإنزيم مع المركب لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. الخطوة الأخيرة هي إضافة ركيزة الحنق ذات السلسلة الخفيفة لبدء التفاعل ، والذي يتم مراقبته باستخدام قارئ لوحة الفلورة. في النهاية ، يجب استخدام الشاشات الثانوية التي تستخدم ركيزة ببتيد غير فلورية لتأكيد النشاط المركب وتحديد الثوابت الحركية الأكثر صرامة مثل ثابت تفكك المثبط أو ki.

الميزة الرئيسية لهذا الاختبار على الطرق الحالية مثل الطرق القائمة على HPLC أو الأساليب القائمة على الخلايا ، هي أنه سهل الأداء ، وسهل التشغيل الآلي ، ويمكن استخدامه لمقارنة الفاعلية النسبية لعدد من المركبات. قد يكافح الأفراد عندما يشعرون بالجدد في هذه الطريقة عند إعداد سلسلة تخفيف مركبة وخلط اللوحة بشكل صحيح بمجرد إضافة جميع المكونات. ابدأ هذا الإجراء بإعداد المخازن المؤقتة والكواشف كما هو موضح في بروتوكول النص.

قم بتكوين قارئ اللوحة لهز اللوحة بسرعة متوسطة لمدة 10 ثوان ، ثم لمراقبة التألق بطول موجة إثارة يبلغ 490 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 523 نانومتر كل خمس دقائق في الوضع الحركي لمدة ساعة و 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد تحديد أنابيب تسمية نطاق تركيز المركب مع اسم المركب المناسب والتركيز ، Eloqua ، 100٪ أكسيد ثنائي ميثيل كبريت أو DMSO لجميع الأنابيب لإعدادها لتخفيف الحبوب المركبة. بعد ذلك ، قم بإعداد التخفيف التسلسلي للمركبات لسلسلة التخفيف القياسية من واحد إلى ثلاثة.

أضف ميكرولترين من المركب غير المخفف إلى أربعة ميكرولترات من DMSO في الأنبوب الأول من سلسلة التخفيف، واخلطه جيدا بطرف ماصة جديد. قم بإزالة ميكرولترين من التخفيف الأول وأضفه إلى أربعة ميكرولترات من DMSO في مزيج الأنبوب الثاني. كرر جيدا للتخفيفات المتبقية.

تأكد من خلط التخفيفات المركبة جيدا للتأكد من دقة تركيزات المركب. قم بتغطية الأنابيب المركبة واتركها جانبا في درجة حرارة الغرفة ، احصل على قاع مسطح ، صفيحة بئر سوداء غير شفافة 96. استخدام إعداد اللوحة الموصى به والذي يمكن العثور عليه في بروتوكول النص.

قم بتوزيع ميكرولتر واحد من التخفيف المركب المعني يدويا مباشرة إلى قاع كل بئر مقابل للآبار من واحد إلى تسعة ، وقم بتوزيع ميكرولتر واحد من أعلى تركيز للمركب ليتم اختباره على البئر.11. لتكون بمثابة التحكم في التألق الجوهري المركب. يهدف هذا التحكم إلى تحديد ما إذا كانت المركبات نفسها فلورية أو تؤثر على التحلل المائي للركيزة.

قم بتوزيع ميكرولتر واحد يدويا من مثبط قوي معروف إلى البئر ، 12 كعنصر تحكم إيجابي وميكرولتر واحد بنسبة 100٪ DMSO للبئر. 10 كعنصر تحكم سلبي مع توزيع ماصة آلي. 79 ميكرولتر من عازلة الفحص على جانب الآبار ، واحد من خلال 10 و 12 و 89 ميكرولتر إلى جانب البئر ، 11-

تأكد من عدم لمس الطرف الموجود في قاع البئر حيث يوجد مركب لتجنب التلوث المتبادل للآبار. دوامة ، إنزيم السلسلة الخفيفة المخفف ، واستخدام ماصة آلية لإضافة 10 ميكرولترات من الإنزيم إلى جانب كل بئر ، باستثناء البئر 11. اضغط برفق على اللوحة للتأكد من أن الحجم الكلي للإنزيم المضاف يذهب إلى قاع البئر ، واخلط الطبق برفق وقم بتغطيته واحتضانه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

توفر هذه الحضانة خطوة توازن أولية للمركبات للارتباط بالسلسلة الخفيفة. قبل إضافة الركيزة ، قم بدوامة السم العصبي للبوتولينوم برفق وهي ركيزة سلسلة خفيفة. ثم باستخدام ماصة آلية ، أضف 10 ميكرولترات من الركيزة إلى جانب كل منها.

حسنا ، تأكد من إضافة الركيزة إلى جانب البئر المقابل للمكان الذي تمت إضافة الإنزيم فيه سابقا. اضغط برفق على اللوحة لخلط الكواشف على الفور. ضع اللوحة في قارئ لوحة ميكروتيتر مضان وابدأ البرنامج الذي تم تكوينه مسبقا.

بعد الانتهاء من البرنامج ، احسب سرعات الإنزيم عن طريق رسم الرسم البياني لوحدة التألق النسبية مقابل الوقت وحساب ميل الخط خلال الفترة الخطية للتفاعل. الاستعداد للتشغيل الآلي للفحص عالي الإنتاجية كما هو موضح في بروتوكول النص, إظهار جزء من بروتوكول الفحص عالية الإنتاجية سيكون دي الشباب ما بعد الدكتوراه في مختبري. سيوضح كيف يتم نقل المركبات إلى ألواح لفحص عالي الإنتاجية باستخدام معدات أتمتة المختبرات بعد الاستغناء عن السم العصبي المخفف للبوتولينوم ، وهو إنزيم سلسلة خفيفة في لوحة الفحص.

قم بتعيين مناطق على منصة معالج السوائل للألواح المركبة وألواح الفحص والحاويات التي تحتوي على محاليل التنظيف. قم ببرمجة معالج السائل لوضع الألواح المركبة وألواح الفحص في المواضع المحددة وإزالة أغطية اللوحة قبل الختم. قم بمعايرة برنامج برنامج الختم وتأكد من غمر دبابيس الختم ولكن لا تخدش الجزء السفلي من لوحة الفحص.

50 نانولترا من المركب مباشرة في لوحة الفحص التي تحتوي على ثمانية ميكرولترات من السموم العصبية للبوتولينوم. سلسلة خفيفة. قم بتنظيف المسامير بعد كل طبق عن طريق غمسها في DMSO ثم تجفيفها على ورق نشاف وتكرار هذه العملية باستخدام الأيزوبروبانول والميثانول.

أخيرا ، جفف المسامير فوق المروحة بعد ختم المركبات في ألواح الفحص بالإنزيم. بشكل منفصل ، قم بتكديس ألواح مركب المخزون وتغطي ألواح الفحص لوحة الفحص العلوية في المكدس لمنع التبخر واتركها جانبا. تأكد من احتضان السلسلة الخفيفة بالمركبات لمدة خمس دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

يمكن استخدام أوقات حضانة أطول عند ختم عدد كبير من اللوحات. أخيرا ، قم بتوزيع الركيزة في لوحات الفحص وقم بقياس التألق كما هو موضح في بروتوكول النص. سواء كنت تقوم بإجراء السم العصبي البوتولينوم القائم على الحنق ، وهو اختبار سلسلة خفيفة في إنتاجية منخفضة أو طريقة إنتاجية عالية ، يجب ملاحظة زيادة في التألق بمرور الوقت عندما يتم احتضان السم العصبي للبوتولينوم ، وهو سلسلة خفيفة مع الركيزة.

إذا تم اختبار التخفيفات التسلسلية للمركب ، فغالبا ما يتم الحصول على سلسلة من الخطوط ذات المنحدرات المختلفة. هنا. يتم سرد التركيز النهائي للمركب القائم على الهيدروكسي في وحدات ميكرومولار. حسنا ، 10 في تخطيط اللوحة الموصوف هنا بمثابة عنصر تحكم سلبي حيث تتم إضافة السيارة فقط.

تعريف معدل هذا التفاعل على أنه 100٪ يمكن تطبيع نشاط الإنزيم والمعدلات في وجود المركب إلى هذا المعدل للحصول على المعدل النسبي أو النسبة المئوية للتثبيط. عندما يتم إجراء الفحص مع التخفيفات التسلسلية لمركب ، يمكن استخدام رسم بياني لمعدل التفاعل مقابل تركيز المثبط لتحديد نصف الحد الأقصى للتركيز المثبط أو IC 50. يجب اختيار نطاق التخفيف بحيث تبدو المؤامرة على شكل سيني لتركيب المنحنى الأمثل.

قيمة IC 50 هي مقياس نسبي للفاعلية أفضل وصف لها بأنها قيمة KI الظاهرة لأنها تعتمد على تركيز الإنزيم الموجود في الفحص. يمكن بعد ذلك استخدام هذه القيمة لمقارنة وترتيب فاعلية العديد من المركبات إذا تم اختبارها. في موازاة ذلك ، يعد الخلط المناسب للوحة بعد إضافة كل مكون أمرا بالغ الأهمية للحصول على زيادة خطية سلسة في التألق بمرور الوقت ، وهو أمر ضروري لتحديد السرعات الأولية بدقة.

تظهر هذه المؤامرة تجربة تمثيلية حيث لم يكن هناك خلط كاف ، ومعدل تكوين المنتج ليس خطيا بمرور الوقت. تحليل البيانات المربك بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن إجراؤه في أقل من ساعتين لما يصل إلى ثمانية مركبات. بعد هذه التجربة ، يمكن إجراء فحوصات أخرى باستخدام ركائز الببتيد غير الفلورية للتأكد من أن المركبات تثبط السم العصبي للبوتولينوم ، والسلسلة الخفيفة ، والنشاط الجسدي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد الفاعلية النسبية لمثبطات السلسلة الخفيفة للسموم العصبية للبوتولينوم. تم إنجاز البروتوكول على ثلاث خطوات. أولا ، إعداد سلسلة التخفيف المركب.

ثانيا ، إضافة إنزيم السلسلة الخفيفة المؤتلف ، وثالثا ، إضافة ركيزة فلورية والقياس اللاحق على قارئ لوحة الفلورسنت.