Name: نموذج في المختبر لدراسة التجميع تاو باستخدام لينتيفيرال-بوساطة الخلايا العصبية البشرية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: اكتشف نموذجًا مخبريًا لدراسة التجميع تاو باستخدام الخلايا العصبية البشرية المعدلة بالفيروسات القهقرية. يتيح هذا الأسلوب تقييم سريع لسمية تاو واختبار العلاجات المحتملة مقارنة بالدراسات الحيوانية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ويود المؤلفون ان يشكروا الدكتور بيتر ديفيس في كليه البرت اينشتاين للطب لتوريد الأجسام المضادة PHF-1 و CP13 والدكتور مارك دايموند في جامعه تكساس ، جنوب غرب ، لتوفير ثوابت تاو. وقد دعم هذا العمل بمنح من جمعيه الزهايمر (NIRG-14-322164) إلى S.H.Y. ومن معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (TB1-01193) إلى شعبي

1. اعداد وسائل الاعلام والكواشف
<ol><li>الذوبان في الطابق السفلي غشاء مصفوفة طلاء للوحات الثقافة في 4 درجه مئوية (لا تسمح مصفوفة غشاء الطابق السفلي لتسخين أو انها سوف يصلب). جعل 1 مل قسامات وتخزينها في-20 درجه مئوية أو-70 درجه مئوية.</li>
	<li>أعاده تكوين الخلايا الليفية الاساسيه عامل النمو (bFGF) في معقم الفوسفات-المالحة المخزنة مؤقتا (التلفزيونية الخاصة) في 10 ميكروغرام/مل وجعل 10 μL aliquots. تخزينها في 4 درجه مئوية.</li>
	<li>إلى زجاجه جديده ، غير مفتوحة ، 500 mL من DMEM/F12 مع الجلوتامين ، أضافه B27 (10 مل) ، N2 (5 مل) ، والبنسلين-ستربتوميسين (5 مل). مكان 50 mL من هذه الخلايا الجذعية العصبية (القومي) وسائل الاعلام في أنبوب مخروطي وأضافه 10 μL من 10 ميكروغرام/μL (2 ميكروغرام/مل النهائي) bFGF. تخزين الاعلام القومي (+) bFGF الوسائط في 4 درجه مئوية.</li>
	<li>لجعل (-) bFGF وسائل الاعلام ، واستخدام نفس الوصفة كما هو موضح في الخطوة 1.3 ولكن لا تضيف bFGF. وسوف تستخدم هذه الوسائط لتفريق NSCs إلى الخلايا العصبية والحفاظ علي الثقافات العصبية بعد التمايز.</li>
</ol>2. لينتيفيرال يبني
ملاحظه: قبل البدء في العمل مع لينتيفيرال ثوابت ، تاكد من ان المختبر قد تمت الموافقة علي استخدام السلامة الاحيائيه مستوي-2 (BSL-2) وكلاء. وعلاوة علي ذلك ، يجب استخدام أغطيه الثقافات من طراز BSL-2 ، ومعدات الوقاية الشخصية ، وأساليب التخلص عند العمل مع ناقلات لينتيفيرال.
<ol><li>الحصول علي يبني تاو تعبئتها في لينتيفيروس من مصدر مفضل (انظر ساندرز وآخرون10 لبناء المعلومات).</li>
</ol>3. زراعه الخلايا الجذعية العصبية البشرية
ملاحظه: وعاده ما يتم البذر NSCs في 100000-150000 الخلايا/سم2 وتباع معظم nscs المتاحة تجاريا ك 1 × 106 خلايا/قارورة. وقد تم تحسين هذا البروتوكول لاطباق الثقافة خليه 10 سم (علي الرغم من ان الاحجام الأخرى من الاطباق يمكن استخدامها) ؛ ولذلك ، إذا تم استخدام NSCs المتاحة تجاريا ، قد تحتاج إلى توسيع NSCs بالأول يجري مثقف في سته اطباق جيدا من أجل ان يؤدي إلى خلايا كافيه للبذور 10 سم الاطباق. ويمكن بدلا من ذلك تكييف هذا البروتوكول لمجموعه متنوعة من الاحجام طبق ثقافة الخلية (ولكن لا يحتوي علي تعليمات لمرور nscs لان هذه البروتوكولات متوفرة في مكان آخر11,12).
<ol><li>
لاعداد لوحات ثقافة الخلية ، وأزاله قسامه واحد من طبقه القبو المجمدة طلاء مصفوفة للوحات ثقافة الخلية والسماح لها لذوبان الجليد في 4 درجه مئوية (يمكن وضع الارصفه في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها اليوم قبل ان يتم البذر الخلايا). أضافه 385 μL من الطابق السفلي غشاء مصفوفة طلاء إلى 5 مل من DMEM/F12 وسائل الاعلام + البنسلين-ستربتوميسين. ملاحظه: 5 مل من الوسائط DMEM/F12 + البنسلين-ستربتوميسين هو ما يكفي لمعطف واحد 10 سم طبق (1 مل من هذا الطابق السفلي غشاء مصفوفة الحل يكفي لمعطف واحد جيدا من سته طبق جيد). بدلا من ذلك ، إذا كانت الخلايا لتكون ثابته ومناعية ، أو ملطخه لثيوفلافين ، والخلايا الثقافية علي الزجاج coverslips في الاطباق الثقافة 24-حسنا.<ol>
<li>الحفاظ علي وسائل الاعلام وطلاء المصفوفة الباردة قبل واثناء اضافتها إلى الاطباق الثقافية. أضافه طلاء مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى الاطباق الثقافية ووضع الاطباق في حاضنه (في 37 درجه مئوية) لمده 1 ساعة. لطلاء الأمثل ، لا احتضان مصفوفة غشاء الطابق السفلي لأكثر من أو اقل من 1 ساعة. بعد 1 ساعة ، يستنشق الطبقة السفلية غشاء طلاء المصفوفة من الثقافات الخلية الاطباق. تاكد من ان هذا يتزامن مع NSCs كونها جاهزه لتكون مطليه. ملاحظه: إذا لم يتم أذابه الخلايا من المخزونات المجمدة ، تخطي الخطوة 3.2 ومتابعه الخطوة 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إذا تم أذابه الخلايا من مخزونات الإنقاذ القومي المجمدة ، خذ قنينة من الخلايا المجمدة وسخنها في حمام مائي يسخن إلى 37 درجه مئوية عن طريق تحريك القارورة ذهابا وإيابا في الماء. مره واحده أذابه ، رش القارورة مع 70 ٪ الايثانول ووضعها في غطاء للثقافة الخلية. نقل الخلايا إلى ~ 10 مل من DMEM/F12 + البنسلين-ستربتوميسين وسائل الاعلام والطرد المركزي أنبوب في درجه حرارة الغرفة في 1,000 x g ل 5 دقيقه. يستنشق وسائل الاعلام وأعاده تعليق الخلايا في وسائل الاعلام القومية.</li>
	<li>تمييع الخلايا في وسائل الاعلام القومية للحصول علي كثافة البذر المناسبة للسفينة ثقافة الخلية التي يتم استخدامها. ملاحظه: علي سبيل المثال ، إذا كانت NSCs مطليه علي لوحه من سته ابار-واحده جيدا علي طبق ثقافة سته جيدا لديها مساحة السطح من 9 سم2-900,000 إلى 1,350,000 خلايا مطلوبه للبذور. لذلك ، يمكن أعاده تعليق قارورة واحده تحتوي علي خلايا 1,000,000 في 2 مل من وسائل الاعلام ، وأضاف إلى بئر واحد من سته طبق جيدا.</li>
	<li>أضافه ما يكفي من الخلايا المعلقة في وسائل الاعلام التابعة لل القومية للبذور الطابق السفلي غشاء مصفوفة المغلفة اطباق الثقافة (100,000 خلايا/سم2) وتغيير وسائل الاعلام كل يوم (إذا كان استخدام الأسهم المجمدة ، وتغيير وسائل الاعلام في اليوم بعد الطلاء وكل يوم بعد ذلك). تنمو الخلايا حتى انها 75 ٪-80 ٪ متموج. ملاحظه: ومن المرجح ان تصل الخلايا إلى 75 ٪-80 ٪ التقاء بعد الطلاء بوقت قصير ، ولكن هذا قد يستغرق وقتا أطول إذا تم استخدام المخزونات المجمدة.</li>
	<li>مره واحده NSCs هي 75 ٪-80 ٪ متموج ، تبدا التمايز العصبية عن طريق أزاله الوسائط الاعلاميه bFGF (+) واستبدالها مع الإنقاذ القومي (-) bFGF وسائل الاعلام. ثقافة الخلايا في هذه الوسائط (استبدال وسائل الاعلام كل يوم) لمده 4 أسابيع علي الأقل. ملاحظه: وسوف تستمر الخلايا في الانقسام لبضعة أيام بعد انسحاب bFGF; لذلك ، قد تصل الخلايا إلى 90-100% التقاء. بعد الخياطة لمده 4 أسابيع ، ستكون الخلايا قد حققت مصير المخ وسوف تكون جاهزه لعلاج لينتيفيروس.</li>
</ol>4. التوصيل والصيانة للثقافات العصبية
<ol><li>إلى transduce الخلايا العصبية مع لينتيفيروس ، واستخدام عدد عيار من 3.4 x 105 وحدات محوله/خليه (100 ٪ متموج 10 سم طبق سوف تحتوي علي ~ 10,000,000 الخلايا العصبية). تمييع الوحدات محوله إلى التركيز اللازم في الخلية ثقافة الاعلام وأضافها إلى الخلايا (استخدام الحجم العادي للوسائط لطبق ثقافة الخلية). بعد يومين من أضافه لينتيفيروس ، وغسل الخلايا 1x مع الطازجة (-) وسائل الاعلام bFGF (بدون لينتيفيروس) ومواصله الخياطة في (-) وسائل الاعلام bFGF كالمعتاد.</li>
	<li>لعلاج ما بعد اللينتيفيرال, تغذيه الخلايا العصبية محوله عن طريق تغيير وسائل الاعلام الخلية الثقافة ([-] وسائل الاعلام bFGF) كل يومين. الحفاظ علي الخلايا ل ~ 8 أسابيع بعد المحول. تصور الخلايا تحت المجهر الضوئي بشكل روتيني لضمان الاستمرارية. ملاحظه: العصافير أو الكسور الجذعية هي علامات علي ان الخلايا لم تعد قابله للحياة.</li>
</ol>5. تصوير الخلايا
<ol><li>
تصوير الخلايا الحية
	<ol>
<li>بعد التوصيل (بعد 4 أيام من أضافه لينتيفيروس) ، راقب إشارات YFP تحت مجهر فلوري قادر علي تصوير الخلايا الحية. تاخذ الاطباق ثقافة الخلية من الحاضنة والتاكد من ان الآبار الثقافة لا تزال عقيمه من خلال الحفاظ علي غطاء علي راس الاطباق الثقافية. تصور الخلايا باستخدام هدف 10x مع الطول الموجي الاثاره من ~ 514 nm وفلتر الانبعاثات من ~ 527 nm. ملاحظه: المجاميع هي عاده مرئية في الثقافات خليه محوله 6-8 أيام بعد تطبيق لينتيفيروس.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
الخلايا الثابتة تلطيخ (β-الأنابيب الثالث وسم وتلطيخ ثيوفلافين)
	<ol>
<li>لإصلاح الخلايا في بارافورمالدهيد (PFA) ، وأزاله وسائل الاعلام الثقافة من الخلايا العصبية المحولة التي تزرع علي الشفتين الزجاج. غسل الخلايا 1x مع تلفزيوني ، وأزاله الغسيل ، وأضافه 300-500 μL (إذا باستخدام لوحات 24 جيدا) من 4 ٪ PFA (المخفف في الخدمات التلفزيونية العامة) إلى coverslips لمده 20 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. أزاله PFA وغسل الشفتين 2x مع تلفزيوني.</li>
		<li>اعداد حل حظر يتالف من تلفزيوني ، 3 ٪ الزلال المصل البقري (جيش الصرب البوسني) ، و 0.3 ٪ تريتون X-100. أضافه 300-500 μL من الحل إلى الآبار واحتضان الشفتين لمده 2 ح في 4 درجه مئوية. بعد 2 ح ، تمييع الأجسام المضادة الاوليه (في تركيز الأجسام المضادة من 1:500) في منع الحل وأضافه 300-500 μL من حل الأجسام المضادة الاساسيه لكل بئر. وضع لوحه علي منصة هزاز أو الدورية (بسرعة منخفضه) بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.</li>
		<li>في اليوم التالي ، وأزاله الحل المضادات الاساسيه وغسل الشفتين 3x لمده 5 دقائق لكل منها مع تلفزيوني. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في حل العازلة الحاجز (بتركيز 1:1000) وأضافه حل الأجسام المضادة الثانوية لكل بئر. حدد الأجسام المضادة الثانوية المناسبة باستخدام علامة الفلورسنت التي لا تتداخل مع اشاره YFP (CY-3 ، علي سبيل المثال). احتضان الخلايا في درجه حرارة الغرفة لمده 2 ساعة علي منصة هزاز أو الدورية. بعد 2 ح ، وأزاله حل الأجسام المضادة الثانوية وغسل الشفتين 3x لمده 10 دقيقه لكل منهما مع تلفزيوني.</li>
		<li>غسل الشفتين في المياه المزدوجة منزوعة الأيونات (DDW) لمده 10 دقيقه. أزاله DDW وأضافه 300 μL/well من 0.015 ٪ ثيوفلافين المخفف في الايثانول 50 ٪ لمده 10 دقيقه. أزاله الحل ثيوفلافين وغسل الشفتين 2x لمده 4 دقائق لكل منهما مع 50 ٪ الايثانول ، تليها واحد 4 دقيقه يغسل مع الايثانول 30 ٪ واثنين يغسل لمده 5 دقائق لكل منها مع الايثانول 30 ٪. غسل الشفتين 1x مع DDW قبل التركيب. ملاحظه: تلطيخ ثيوفلافين الموصوفة في الخطوة 5.2.4 اختياريه.</li>
		<li>لتركيب الشفتين علي الشرائح الزجاجية ، ضع قطره واحده من الوسائط المتصاعدة علي الجانب "+" من الشريحة الزجاجية. أزاله كل السائل من البئر التي تحتوي علي الزجاج كوفيرسليب ، وذلك باستخدام ملقط غرامه ، وأزاله بعناية الزجاج كوفيرسليب ، والحفاظ علي المسار الذي الجانب لديه خلايا مثقف.</li>
		<li>اضغط برفق علي حافه الشفة المختلطة ضد Kimwipe لأزاله اي رطوبة زائده. لا تزال تجتاح كوفيرسليب مع ملقط غرامه ، وتلمس الحافة (مع الجانب الخلية التي تواجه نحو قطره من وسائل الاعلام المتصاعدة) من كوفيرسليب إلى وسائل الاعلام المتصاعدة ، ومن ثم ، وضع بلطف في كوفيرسليب علي وسائل الاعلام المتصاعدة (وضع الخلايا المستزرعة في تصاعد وسائل الاعلام ويقحمها بين المشبك والشريحة الزجاجية). السماح للوسائط المتصاعدة لتتصلب لمده 30 دقيقه قبل التصوير. يمكن تخزين الشرائح في-20 درجه مئوية للاستخدام في المستقبل.</li>
		<li>صوره الخلايا باستخدام المجهر الفلورسنت والمناسبة الاثاره/الانبعاثات الأطياف (YFP = ~ 514/527 نانومتر ، CY-3 = ~ 555/568 nm ، و ثيوفلافين S = ~ 390/426 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. الطرق الاختيارية
<ol><li>كل يومين ، وجمع وسائل الاعلام المكيفة من الثقافات وتخزينها في-20 درجه مئوية للتحليلات في المستقبل من الأنواع تاو التي أطلقتها الثقافات.</li>
</ol>

<ol><li>Rojas, J. C., Boxer, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+disease+in+2015%3A+Targeting+tauopathies+for+therapeutic+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).</li>
<li>Kadavath, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+stabilizes+microtubules+by+binding+at+the+interface+between+tubulin+heterodimers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).</li>
<li>Wang, Y., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+in+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Tau in physiology and pathology.</a> Nature Reviews Neurology. 17 (1), 5-21 (2016).</li>
<li>Gomez-Ramos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+consequences+of+muscarinic+receptor+activation+by+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22European+Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein.</a> European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).</li>
<li>Warmus, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau-mediated+NMDA+receptor+impairment+underlies+dysfunction+of+a+selectively+vulnerable+network+in+a+mouse+model+of+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia.</a> Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).</li>
<li>DeVos, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+reduction+in+the+presence+of+amyloid-beta+prevents+tau+pathology+and+neuronal+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo.</a> Brain. 141 (7), 2194-2212 (2018).</li>
<li>Cheng, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+reduction+diminishes+spatial+learning+and+memory+deficits+after+mild+repetitive+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice.</a> PLOS ONE. 9 (12), e115765(2014).</li>
<li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+human+mutant+tau+aggregation+by+knocking+out+murine+tau+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model.</a> The American Journal of Pathology. 178 (2), 803-816 (2011).</li>
<li>Reilly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+human+neuronal+tau+model+exhibiting+neurofibrillary+tangles+and+transcellular+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation.</a> Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).</li>
<li>Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-cellular+Propagation+of+Tau+Aggregation+by+Fibrillar+Species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).</li>
<li>Yuan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+marker+signatures+for+the+isolation+of+neural+stem+cells%2C+glia+and+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells.</a> PLOS ONE. 6 (3), e17540(2011).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging human neural stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e263(2007).</li>
<li>Lathuiliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motifs+in+the+tau+protein+that+control+binding+to+microtubules+and+aggregation+determine+pathological+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13556(2017).</li>
<li>Asai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+microglia+and+inhibition+of+exosome+synthesis+halt+tau+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation.</a> Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).</li>
</ol>

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

يصف هذا البروتوكول توليد نموذج في المختبر لاعتلال الأمعاء البشرية الذي يسلك المجاميع الايجابيه للبقع الفضية والتشابك العصبي الليفي ثيوفلافين الإيجابي (NFTs). وعلاوة علي ذلك ، تعرض الخلايا المحولة الامراض التي يسببها تاو مثل العيوب المورفولوجية ، وانخفاض synaptogenesis ، وزيادة حجم الليسومال. والميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو انه يوفر نموذجا يمكن الوصول اليها وفعاله من حيث التكلفة لاعتلال الخلايا العصبية ، والتي يمكن استخدامها لدراسات فحص المخدرات ، وكذلك لتحليل سميه تاو. هذا النموذج يملا حاجه المادية في البحوث العصبية ...

التراكم المرضي من البروتين المرتبط بالبولية الصغيرة تاو هو سمه مميزه للعديد من الامراض التنكسية ، بما في ذلك AD ، الخرف الجبهي الامامي (FTD) ، ومرض البيك ، والشلل التقدمي التقدمي (PSP)1. في حاله غير المريضة ، تاو يربط ويستقر خيوط ميكروتوبولي في محاور الخلايا العصبية2. ومع ذلك ، والمرتبطة بالمرض فرط فوسفونات تاو يعزز تجميع تاو ، التفكك من الأنابيب الدقيقة ، وسميه الخلايا العصبية3. الآثار السامة لل تاو المجمعة قد تنطوي علي تفعيل الشاذة من الكوليني4 ومستقبلات جلوتاميلجيك5 مما ادي إلى خلل في الكالسيوم داخل الخلايا و, في نهاية المطاف, موت الخلية. في النماذج الحيوانية ، والحد من الدماغ تاو يحسن علم الامراض في الفئران AD6 وفي نماذج الماوس من المتكررة خفيفه أصابه الدماغ الرضية7.
تثبت الادله المتصاعدة ان البنية والصلة الملزمة لل tau المشتقة من الفاره تختلف عن المشتقة البشرية تاو وان الماوس تاو غير مناسب لنمذجة الإنسان8. ومع ذلك ، فان نماذج اعتلال الخلايا البشرية ليست متاحه تجاريا علي نطاق واسع. الهدف العام لهذا العمل هو وصف نموذج في المختبر من تجميع تاو فيه الخلايا العصبية البشرية محوله مع ناقلات المشتقة من لينتيفيرال التي تحتوي علي متحولة الإنسان تاو يبني9. تاو التجميعية المسببة للينتيفيرال يبني رموز للمجال التكرار تاو إيواء P301L والطفرات الV337Mه تنصهر إلى مراسل YFP (تاو-RDLM-YFP) في حين ان التحكم بإنشاء التعليمات البرمجية للمجال البرية من نوع (Wt) تاو تكرار تنصهر إلى مراسل YFP (تاو-Wt-YFP). الثقافات العصبية محوله باستخدام هذه الطريقة التعبير عن حوالي تسع مرات أكثر تاو من الثقافات غير المحولة. وعلي الرغم من ان مقدار تعبير تاو المعبر عنه يساوي تقريبا بين الخلايا المحولة من تاو-RDLM-YFP-و Tau-Wt-YFP ، فان الخلية العصبية الوحيدة المحولة مع المجاميع العرض تاو-RDLM-YFP. الثقافات محوله مع تاو-rdlm-yfp وصمه عار إيجابيا لثيوفلافين وعرض التخفيضات في طول محواري وكثافة متشابك. ولذلك ، قد يكون هذا النموذج الخلوي أداه مفيده لدراسة تجميع تاو في المختبر.

<table><tbody><tr><td>أطباق استزراع 10 سم</td><td>Thermofisher</td><td>12556002</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب 15 مل Biopioneer</td><td></td><td>CNT-15</td><td></td></tr><tr><td>16٪ بارافورمالدهيد</td><td>ثيرموفيشر</td><td>50-980-487</td><td></td></tr><tr><td>24 لوحة ثقافة بئر</td><td>Thermofisher</td><td>930186</td><td></td></tr><tr><td>50 مل أنابيب</td><td>Biopioneer</td><td>CNT-50</td><td></td></tr><tr><td>70٪ إيثانول في زجاجة</td> <td>رذاذمصادر مختلفة</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>B27 مكمل</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>مصفوفة غشاء القاعدية (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>أساسي FGF</td><td>Biopioneer</td><td>HRP-0011</td><td></td></tr><tr><td>ألبومين مصل الأبقار</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>حاضنة ثقافة الخلايا</td><td>مصادر مختلفة</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>أجهزة الطرد المركزي</td><td>مصادر مختلفة</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 وسائط الثقافة مع الجلوتامين</td><td>Thermofisher</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>الإيثانول (تركيز 50٪ أو أعلى)</td> <td>مصادر مختلفة</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>الأجسام المضادة الثانوية المسماة</td> فلورسينتلي <td>مصادر مختلفة ، تعتمد على التجربة</td><td></td> مجهر NA <td></td></tr><tr><td>الفلوري</td><td>مصادر مختلفة</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>أغطية زجاجية</td><td>Thermofisher</td><td>1254581</td><td></td></tr><tr><td>شرائح زجاجية</td><td>Thermofisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>الخلايا الجذعية العصبية البشرية</td><td>مصادر مختلفة</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ناقلات الفيروسات العدسية</td><td>مصادر مختلفة</td><td>ترتيب</td><td></td>مخصص</tr><tr><td>وسائل الإعلام تصاعد</td><td>Thermofisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>N2 الملحق</td><td>Thermofisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>البنسلين الستربتومايسين</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>الفوسفات المحلول</td><td>الملحي المخزن Thermofisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>الأجسام المضادة الأولية</td><td>مصادر مختلفة ، تعتمد على التجربة</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>هزاز أو منصة دوارة</td><td>مصادر مختلفة</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>غطاء ثقافة</td> <td>الخلايا المعقمةمصادر مختلفة</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin S</td><td>Sigma</td><td>T1892-25G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermofisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>حمام مائي</td><td>مصادر مختلفة</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

نموذج في المختبر لدراسة التجميع تاو باستخدام لينتيفيرال-بوساطة الخلايا العصبية البشرية

An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons

التراكم الشاذ من البروتين تاو يشارك بشكل مرضي في عدد من الامراض التنكسية ، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD). علي الرغم من ان نماذج الفئران من تواعتلال قدمت موردا قيما للتحقيق في أليات العصبية من تاو المجمعة ، فانه أصبح من الواضح علي نحو متزايد انه ، بسبب الاختلافات بين الأنواع في الفيزيولوجيا العصبية ، والدماغ الماوس غير مناسب نمذجة الحالة الانسانيه. التقدم في أساليب ثقافة الخلية جعلت ثقافات الخلايا العصبية البشرية في متناول للاستخدام التجريبي في المختبر وساعدت في تطوير المداواة العصبية. ومع ذلك ، علي الرغم من التكيف مع الثقافات خليه الخلايا العصبية البشرية ، في المختبر نماذج من الاعتلال البشري ليست متاحه علي نطاق واسع حتى الآن. يصف هذا البروتوكول نموذجا خلويا لتجميع تاو الذي يتم فيه توصيل الخلايا العصبية البشرية بالمتجات المشتقة من لينتيفيرال التي تم دمجها بالشفرة المتحولة بشكل باثوجيوكلي مع مراسل البروتين الفلوري الأصفر (YFP). الثقافات المحولة تنتج المجاميع تاو ان وصمه عار إيجابيا لثيوفلافين وعرض علامات السمية العصبية ، مثل انخفاض طول اكسنال وزيادة حجم الليسومال. وقد يكون هذا الاجراء نموذجا مفيدا وفعالا من حيث التكلفة لدراسة الامراض البشرية.

تم المفتاحية تاو-RDLM-YFP-محول الخلايا العصبية فلوريسسينتلي مع YFP ، والثقافات RDLM-محول عرض المجاميع بعد المحولة. هذه الشوائب الملونة الايجابيه لثيوفلافين (الشكل 1). كما يوضح الشكل 1 ، ينتج هذا البروتوكول ثقافات الخلايا العصبية التي تعرض مجاميع tau الموجبة لثيوفلافين. للتجارب الاوليه ، فمن المستحسن ان يتم تاكيد تمايز الخلايا العصبية عن طريق المناعية علامة الخلايا العصبية الخاصة β-أنابيب الثالث في الثقافات. الأهم من ذلك ، ينبغي ان يكون الأجسام المضادة الثانوية ف...

هذا البروتوكول تفاصيل الاجراء الذي يتم محول الثقافات العصبية البشرية مع لينتيفيرال ثوابت الترميز لمتحولة تاو الإنسان. الثقافات محوله عرض المجاميع تاو والامراض المرتبطة بها.

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). ...

في هذا البروتوكول نحن بالتفصيل نموذج في المختبر من اعتلال التوابع البشرية. هذه الطريقة تملأ الحاجة المواد التي قد تكون مفيدة لفحص المخدرات ودراسات آلية المرض. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن نموذج ثقافة الخلية يسمح بإجراء تقييم أسرع لسمية تاو والعلاجات المحتملة تاو مقارنة بالدراسات الحيوانية لبدء هذا الإجراء ذوبان مصفوفة غشاء الطابق السفلي لطلاء الألواح الزرعية عند أربع درجات مئوية.جعل aliliter ملليلتر واحد وتخزينها في ناقص 20 أو ناقص 70 درجة مئوية. بعد ذلك، إعادة تشكيل عامل النمو الليفي الأساسي في برنامج تلفزيوني عقيمة بتركيز 10 ميكروغرام لكل ملليلتر. جعل 10 ميكرولتر aliquots وتخزينها في أربع درجات مئوية.ثم وضعت خارج زجاجة جديدة غير مفتوحة 500 ملليلتر من DMEM-F12 مع الجلوتامين. إضافة 10 ملليلتر من B27، وخمسة ملليلتر من N2، وخمسة ملليلتر من البنسلين ستربتوميسين لإعداد وسائل الإعلام الخلايا الجذعية العصبية. ضع 50 ملليلتر من وسائط NSC في أنبوب مخروطي ، وأضف 10 ميكرولترات من bFGF المعدة.تخزين هذه NSC بالإضافة إلى وسائل الإعلام bFGF في أربع درجات مئوية. أولا، إزالة aliquot من مصفوفة غشاء الطابق السفلي المجمدة طلاء للوحات ثقافة الخلية من الثلاجة والسماح للذوبان في أربع درجات مئوية. إضافة 385 ميكرولترات من طلاء مصفوفة غشاء الطابق السفلي المذاب إلى خمسة ملليلترات من وسائل الإعلام DMEM-F12 التي تحتوي على البنسلين-ستريبتوميسين.إذا تم إذابة الخلايا من مخزونات NSC المجمدة، تأخذ قارورة من الخلايا المجمدة من الثلاجة وتدفئة في حمام مائي تسخينها إلى 37 درجة مئوية عن طريق تحريك القارورة ذهابا وإيابا في الماء. بعد هذا، رش القارورة بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم تحت غطاء الخلية ثقافة، نقل الخلايا إلى ما يقرب من 10 ملليلتر من وسائل الاعلام DMEM-F12 التي تحتوي على البنسلين-ستريبتوميسين.جهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة عند 1000 مرة ز لمدة خمس دقائق. ثم تُشعّر الوسائط وتُعيد تعليق الخلايا في وسائط المركز الوطني لC. تخفيف الخلايا في وسائط NSC للحصول على كثافة البذر المناسبة للسفينة ثقافة الخلية التي يتم استخدامها.إضافة ما يكفي من الخلايا المعلقة في وسائل الإعلام NSC لزرع مصفوفة غشاء الطابق السفلي المغلفة أطباق الثقافة. تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تكون 75 إلى 80٪التقاء، مع التأكد من تغيير وسائل الإعلام كل يومين. إلى الخلايا العصبية transduce مع العد، استخدام عدد تتر من 340،000 وحدات محولة لكل خلية.تخفيف وحدات تحويل في وسائل الإعلام ثقافة الخلية إلى التركيز اللازم، وإضافتها إلى الخلايا. بعد يومين من إضافة فيروس العدس، وغسل الخلايا مرة واحدة مع وسائل الإعلام الطازجة التي لا تحتوي على bFGF. مواصلة زراعة الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في وسائل الإعلام دون bFGF.الحفاظ على الخلايا لمدة ثمانية أسابيع بعد عملية النقل، مع التأكد من تغيير وسائل الإعلام خلية ثقافة كل يوم. استخدام المجهر الخفيف لتصور روتينية الخلايا وضمان البقاء. بعد عملية النقل، قم بإزالة أطباق الثقافة من الحاضنة مع التأكد من الحفاظ على الغطاء عليها للحفاظ على الثقافة معقمة بشكل جيد.استخدام المجهر الفلورسنت قادرة على التصوير الخلية الحية لتصور الخلايا تحت هدف 10X مع استثارة من 514 نانومتر ومرشح انبعاث من 527 نانومتر. في هذه الدراسة الخلايا العصبية التي تم تحويلها مع تاو RDLM-YFP يتم وضع علامات الفلوري مع YFP. يتم رؤية الثقافات التي يتم تحويلها RDLM لعرض المجاميع بعد النقل.هذه التضمين وصمة عار إيجابية للثيوفلافين. يتم تأكيد التمايز العصبي عن طريق التميّز من علامة بيتا-توبولين الثالث الخاصة بالخلايا العصبية في الثقافات. ومن المهم أن نتذكر أن الأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالفلورسنت ينبغي أن يكون لها طيف من الانبعاثات الإثارة لا يتداخل مع طيف YFP.على الرغم من أن مجاميع الفلوريسنس تاو الصفراء ستكون مرئية في غياب تلطيخ، وينبغي أيضا أن تستخدم ثيوفلافين للتصوير من أجل التأكد من أن الإشارة الفلورسنت هي تاو تجميعها لا الحطام الخلوي. بعد جيل من الخلايا تاو overexpressing، يمكن إجراء عدد من التقييمات لصحة الخلايا العصبية وتجميع تاو. على سبيل المثال، وجدنا أن هذه الخلايا تعرض انحطاطاً عصبياً.بالإضافة إلى دراسات زراعة الخلايا، استخدمنا هذه الطريقة لفحص تاو الإمراضية المشتقة من الزومات.

an-vitro-model-for-studying-tau-aggregation-using-lentiviral-mediated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

يعرض هذا الفيديو فحصا قائما على الخلايا يحدد امتصاص تاو بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة الفئران باستخدام مجاميع تاو المسماة بالفلورسنت الحساسة للأس الهيدروجيني ، والتي تم تحليلها عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة لإجراء تقييم كمي.

اختبار قائم على الخلايا لتقييم امتصاص بروتين تاو بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة

يوضح هذا الفيديو عملية تحفيز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات على التمايز إلى خلايا عصبية عن طريق نقلها بفيروسات عدسية هندسية تحمل جين عامل النسخ العصبي تحت سيطرة عنصر مستجيب للتتراسيكلين ، يليه العلاج بمشتق التتراسيكلين ووسط النضج.

تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في الخلايا العصبية باستخدام فيروسات العدسات المهندسة

يوضح هذا الفيديو عملية تحويل الخلايا العصبية البشرية بفيروس عدسي يشفر بروتين تاو بشري متحور ببروتين فلورسنت أصفر (YFP) لدراسة تراكم البروتين. يحدد الخطوات من دخول الفيروس إلى تعبير تاو المتحور ، وتبلغ ذروتها في تكوين مجاميع تاو السيتوبلازمية المرئية في الخلايا العصبية.

نقل الخلايا العصبية البشرية بوساطة الفيروسات العدسية لتحليل تجميع بروتين تاو

واستخدمت البروتينات تاو معدلة وhyperphosphorylated في اثنين من فحوصات في المختبر تجميع للكشف عن حركية تجميع سريع تعتمد على hyperphosphorylation. هذه المقايسات تمهد الطريق لشاشات المستقبلية للمركبات التي يمكن أن تعدل بميل تاو hyperphosphorylated لتشكيل الألياف التي تكمن وراء تطور مرض الزهايمر.

في المختبر تجميع فحوصات عن طريق Hyperphosphorylated تاو البروتين

ويصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل واستزراع الماوس الأساسي الحبيبية الدماغي الخلايا العصبية (كنس) من يوم 6-7 القديمة الجراء، كفاءة توصيل لكنس للخسارة والحصول على دراسات مهمة، ونمذجة excitotoxicity الخلايا العصبية التي يسببها نمدا، موت الخلايا التي يسببها البوتاسيوم منخفضة وتلف الحمض النووي، والأكسدة باستخدام نفس نموذج الثقافة.

وضع نماذج لموت الخلايا العصبية وضمور في الخلايا العصبية الأولية الحبيبية للدماغ الماوس

التحليل تجميع تاو الموصوفة في هذه المخطوطة يحاكي الميزات المتوقعة في فيفو ميسفولدينج تاو والتجميع.

في المختبر المقايسة لدراسة تجميع البروتين تاو وفحص المخدرات

هنا يصف لنا تحليل يستند إلى الخلية كمياً تقييم امتصاص تاو طريق microglia بهدف إنشاء أداة الفحص لوصف أفضل آليات العمل تاو المضادة الأجسام المضادة.

تحليل يستند إلى الخلية لدراسة التخليص تاو جسم بوساطة من Microglia

تاو هو بروتين الخلايا العصبية الموجودة علي حد سواء في السيتوبلاسما ، حيث انه يربط الأنابيب الدقيقة ، وفي النواة ، حيث يمارس وظائف غير تقليديه بما في ذلك تحوير الجينات المرتبطة بمرض الزهايمر. هنا ، ونحن وصف طريقه للتحقيق في وظيفة تاو النووية في حين استبعاد اي تدخلات قادمه من السيتوبلازمي تاو.

تعديل التعريب تاو Subcellular كاداه للتحقيق في التعبير عن الجينات المرتبطة بالمرض

مطلوب نموذج فسيولوجي في الجسم الحي من α-synuclein لدراسة وفهم التسبب في مرض باركنسون. وصفنا طريقة لمراقبة السمية الخلوية والتكوين الكلي ل α-synuclein باستخدام نموذج الخميرة المتوافق مع البشر.

طريقة لدراسة سمية α-سينوكلين وتجميعها باستخدام نموذج خميرة متوافق مع البشر

نوضح هنا كيفية الجمع بين نقل الخلايا العصبية للقوارض الحصين الأولية مع التصوير البؤري للخلايا الحية لتحليل التأثيرات المرضية التي يسببها البروتين على النقل المحوري وتحديد المسارات الميكانيكية التي تتوسط هذه الآثار.

استخدام تصوير الخلايا الحية لقياس آثار البروتينات المرضية على النقل المحوري في الخلايا العصبية الحصينية الأولية

تحدث ترنح البوليغلوتامين الشوكي المخيخي نتيجة توسعات CAG التي تنتج بروتينات عرضة للتجمع. يصف هذا البروتوكول إنتاج الناقلات، وتوصيل الإشارات المجسمة، وتحليل الشوائب وفقدان العلامات العصبية، موفرا منصة محكمة لدراسة الآليات وتقييم العلاجات المستهدفة للأمراض التنكسية العصبية.

علم الأمراض المخططة الناتج عن الفيروسات اللينتيفيرالية كنموذج ما قبل سريري لترنح الدماغ العمودي الدماغي المضحك بالبوليغلوتامين

اكتشف نموذجًا مخبريًا لدراسة التجميع تاو باستخدام الخلايا العصبية البشرية المعدلة بالفيروسات القهقرية. يتيح هذا الأسلوب تقييم سريع لسمية تاو واختبار العلاجات المحتملة مقارنة بالدراسات الحيوانية.

نموذج في المختبر لدراسة التجميع تاو باستخدام لينتيفيرال-بوساطة الخلايا العصبية البشرية

استكشف المزيد من الفيديوهات