An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons

Brent Aulston; Qing Liu; Patrick Reilly; Shauna H. Yuan

doi:10.3791/59433

نموذج في المختبر لدراسة التجميع تاو باستخدام لينتيفيرال-بوساطة الخلايا العصبية البشرية

JoVE Journal
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Neuroscience

An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons

نموذج في المختبر لدراسة التجميع تاو باستخدام لينتيفيرال-بوساطة الخلايا العصبية البشرية

Full Text

6,361 Views

05:51 min

May 23, 2019

DOI: 10.3791/59433-v

Brent Aulston¹, Qing Liu¹, Patrick Reilly¹, Shauna H. Yuan¹

¹Department of Neurosciences,University of California, San Diego

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study outlines a protocol for establishing an in vitro model of human tauopathy by transducing neuronal cultures with lentiviral constructs coding for mutant human tau. The model facilitates rapid assessment of tau toxicity and potential therapeutics compared to traditional animal studies.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Cell Biology
Tauopathies

Background

Human tauopathies are neurodegenerative diseases characterized by tau protein aggregation.
Traditional models often involve long timelines and are not always reflective of human pathology.
This protocol presents a quicker and more specific assessment paradigm through cell cultures.
It addresses the limitations of animal models in studying tau protein interactions.

Purpose of Study

To develop a human neuronal culture model for studying tau pathology.
To aid in drug screening for tau-related diseases.
To facilitate understanding of tau's role in neurodegeneration.

Methods Used

The platform utilized is a human neuronal cell culture system.
The biological model consists of human neurons transduced with mutant tau using lentiviral constructs.
No multiomics workflow is mentioned in the text.
Cells are maintained for about eight weeks post-transduction, with regular media changes.
Light and fluorescent microscopy are employed to visualize tau aggregation.

Main Results

The transduced cultures displayed tau aggregates, confirmed by thioflavin staining.
Neuronal differentiation was validated through immunolabeling of beta-tubulin III.
Observations indicated axonal degeneration among the tau-overexpressing cells.
The study highlights the viability of using this model for evaluating tau-related neuronal health.

Conclusions

This study demonstrates a reliable in vitro approach to explore tauopathies and assess tau toxicity.
The developed model opens avenues for testing potential tau therapeutics.
Insights gained can enhance understanding of the mechanisms behind tau aggregation and neurodegeneration.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of this in vitro model?

This model allows for quick assessment of tau toxicity and therapeutic interventions, reducing the time and complexity associated with animal studies.

How is the neuronal culture established?

Neuronal cultures are established by thawing basement membrane matrix and then using basic fibroblast growth factor to enhance neural stem cell growth.

What types of outcomes can be observed?

Outcomes include tau aggregation visualization, assessments of neuronal health, and potential pathologies such as axonal degeneration.

How can this method be applied in research?

Researchers can use this model for drug screening and to investigate the mechanisms underlying tau-related neurodegenerative diseases.

Are there any limitations to this model?

While this model allows for rapid experimentation, it may not completely replicate the complex in vivo environment of a living organism.

What confirmation techniques are used for neuronal differentiation?

Immunolabeling with neuron-specific markers such as beta-tubulin III is utilized to confirm neuronal differentiation in cultures.

هذا البروتوكول تفاصيل الاجراء الذي يتم محول الثقافات العصبية البشرية مع لينتيفيرال ثوابت الترميز لمتحولة تاو الإنسان. الثقافات محوله عرض المجاميع تاو والامراض المرتبطة بها.

في هذا البروتوكول نحن بالتفصيل نموذج في المختبر من اعتلال التوابع البشرية. هذه الطريقة تملأ الحاجة المواد التي قد تكون مفيدة لفحص المخدرات ودراسات آلية المرض. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن نموذج ثقافة الخلية يسمح بإجراء تقييم أسرع لسمية تاو والعلاجات المحتملة تاو مقارنة بالدراسات الحيوانية لبدء هذا الإجراء ذوبان مصفوفة غشاء الطابق السفلي لطلاء الألواح الزرعية عند أربع درجات مئوية.

جعل aliliter ملليلتر واحد وتخزينها في ناقص 20 أو ناقص 70 درجة مئوية. بعد ذلك، إعادة تشكيل عامل النمو الليفي الأساسي في برنامج تلفزيوني عقيمة بتركيز 10 ميكروغرام لكل ملليلتر. جعل 10 ميكرولتر aliquots وتخزينها في أربع درجات مئوية.

ثم وضعت خارج زجاجة جديدة غير مفتوحة 500 ملليلتر من DMEM-F12 مع الجلوتامين. إضافة 10 ملليلتر من B27، وخمسة ملليلتر من N2، وخمسة ملليلتر من البنسلين ستربتوميسين لإعداد وسائل الإعلام الخلايا الجذعية العصبية. ضع 50 ملليلتر من وسائط NSC في أنبوب مخروطي ، وأضف 10 ميكرولترات من bFGF المعدة.

تخزين هذه NSC بالإضافة إلى وسائل الإعلام bFGF في أربع درجات مئوية. أولا، إزالة aliquot من مصفوفة غشاء الطابق السفلي المجمدة طلاء للوحات ثقافة الخلية من الثلاجة والسماح للذوبان في أربع درجات مئوية. إضافة 385 ميكرولترات من طلاء مصفوفة غشاء الطابق السفلي المذاب إلى خمسة ملليلترات من وسائل الإعلام DMEM-F12 التي تحتوي على البنسلين-ستريبتوميسين.

إذا تم إذابة الخلايا من مخزونات NSC المجمدة، تأخذ قارورة من الخلايا المجمدة من الثلاجة وتدفئة في حمام مائي تسخينها إلى 37 درجة مئوية عن طريق تحريك القارورة ذهابا وإيابا في الماء. بعد هذا، رش القارورة بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم تحت غطاء الخلية ثقافة، نقل الخلايا إلى ما يقرب من 10 ملليلتر من وسائل الاعلام DMEM-F12 التي تحتوي على البنسلين-ستريبتوميسين.

جهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة عند 1000 مرة ز لمدة خمس دقائق. ثم تُشعّر الوسائط وتُعيد تعليق الخلايا في وسائط المركز الوطني لC. تخفيف الخلايا في وسائط NSC للحصول على كثافة البذر المناسبة للسفينة ثقافة الخلية التي يتم استخدامها.

إضافة ما يكفي من الخلايا المعلقة في وسائل الإعلام NSC لزرع مصفوفة غشاء الطابق السفلي المغلفة أطباق الثقافة. تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تكون 75 إلى 80٪التقاء، مع التأكد من تغيير وسائل الإعلام كل يومين. إلى الخلايا العصبية transduce مع العد، استخدام عدد تتر من 340،000 وحدات محولة لكل خلية.

تخفيف وحدات تحويل في وسائل الإعلام ثقافة الخلية إلى التركيز اللازم، وإضافتها إلى الخلايا. بعد يومين من إضافة فيروس العدس، وغسل الخلايا مرة واحدة مع وسائل الإعلام الطازجة التي لا تحتوي على bFGF. مواصلة زراعة الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في وسائل الإعلام دون bFGF.

الحفاظ على الخلايا لمدة ثمانية أسابيع بعد عملية النقل، مع التأكد من تغيير وسائل الإعلام خلية ثقافة كل يوم. استخدام المجهر الخفيف لتصور روتينية الخلايا وضمان البقاء. بعد عملية النقل، قم بإزالة أطباق الثقافة من الحاضنة مع التأكد من الحفاظ على الغطاء عليها للحفاظ على الثقافة معقمة بشكل جيد.

استخدام المجهر الفلورسنت قادرة على التصوير الخلية الحية لتصور الخلايا تحت هدف 10X مع استثارة من 514 نانومتر ومرشح انبعاث من 527 نانومتر. في هذه الدراسة الخلايا العصبية التي تم تحويلها مع تاو RDLM-YFP يتم وضع علامات الفلوري مع YFP. يتم رؤية الثقافات التي يتم تحويلها RDLM لعرض المجاميع بعد النقل.

هذه التضمين وصمة عار إيجابية للثيوفلافين. يتم تأكيد التمايز العصبي عن طريق التميّز من علامة بيتا-توبولين الثالث الخاصة بالخلايا العصبية في الثقافات. ومن المهم أن نتذكر أن الأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالفلورسنت ينبغي أن يكون لها طيف من الانبعاثات الإثارة لا يتداخل مع طيف YFP.

على الرغم من أن مجاميع الفلوريسنس تاو الصفراء ستكون مرئية في غياب تلطيخ، وينبغي أيضا أن تستخدم ثيوفلافين للتصوير من أجل التأكد من أن الإشارة الفلورسنت هي تاو تجميعها لا الحطام الخلوي. بعد جيل من الخلايا تاو overexpressing، يمكن إجراء عدد من التقييمات لصحة الخلايا العصبية وتجميع تاو. على سبيل المثال، وجدنا أن هذه الخلايا تعرض انحطاطاً عصبياً.

بالإضافة إلى دراسات زراعة الخلايا، استخدمنا هذه الطريقة لفحص تاو الإمراضية المشتقة من الزومات.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos