دراسة الحمض النووي عن طريق حلقات جزيء واحد الحنق

تقدم هذه الدراسة إجراء التجارب مفصلة لقياس ديناميكية حلقات من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل باستخدام جزيء واحد نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق). يصف البروتوكول أيضا كيفية استخراج كثافة الاحتمال حلقات يسمى عامل J.

الهدف العام من التجربة التالية هو التحقيق في كيفية تأثر ديناميكيات الحلقات للحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل بالشكل الجوهري للحمض النووي دون استخدام بروتينات ربط الحمض النووي. يتم تحقيق ذلك عن طريق دمج جزيئات الصبغة في شظايا الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بهم السبل ذات انحناءات مختلفة بحيث يمكن مراقبة حلقات الحمض النووي عن طريق رنين التألق أو نقل الطاقة أو الحنق. يمكن بعد ذلك ملاحظة أحداث الحلقات القابلة للانعكاس وأحداث التكرار من جزيئات الحمض النووي المفردة عن طريق الفحص المجهري للانعكاس الداخلي الكلي.

يمكن بعد ذلك استقراء معدل تكرار الحمض النووي من المسارات الزمنية لكل جزيء مضان على حدة. في النهاية ، يمكن قياس احتمالية تكرار الحمض النووي فيما يتعلق بالشكل الجوهري للجزء. الميزة الرئيسية لمقايسة حلقات الحمض النووي هذه هي أنه لا يعتمد على بروتين ربط الحمض النووي ، والذي قد يؤثر على حركية التكرار للحمض النووي.

يدور البروتوكول البسيط حول استخدام تقنية تسمى نقل طاقة الرنين الفلوري ، وتوليف الحمض النووي القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). لقياس احتمالية بحث الحمض النووي ، ابدأ بتصميم الحمض النووي المنحني عالميا عن طريق تكرار تسلسل 10 MER. على سبيل المثال ، هذا التسلسل التمثيلي هو 186 زوجا أساسيا من الحمض النووي المنحني ، حيث X عبارة عن قاعدة إضافية عشوائية والتسلسلات التي تحيط بتسلسل 10 mers المتكرر هي تسلسلات محول.

بعد ذلك ، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات الأول والثاني باستخدام المتبرع الحنق SI ثلاثة وضع العلامات على التمهيدي الثاني في النهاية الأولية الخمسة. ثم قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات الثالثة والرابعة مع متقبل الحنق SCI خمسة وضع العلامات من خلال العمود الفقري ورابط البيوتين في الطرف الخامس الرئيسي من التمهيدي الثالث. بعد تنقية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعة تنظيف PCR ، امزج المنتجات المصابة بثلاثة SCI والمنتجات ذات العلامات الخمسة SCI في مخزن مؤقت لتبادل الخيوط بتركيزات نهائية تبلغ 0.4 ميكرومولار و 0.1 ميكرومولار على التوالي.

ثم احتضان الخيوط عند 98.5 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، مع التبريد التدريجي إلى خمس درجات مئوية بمعدل منحدر 0.1 درجة مئوية في الثانية ، ثم تحتضن عند خمس درجات مئوية لمدة ساعتين. لتبادل الخيوط لإعداد خلية التدفق ، استخدم مكبس الحفر ولقم الثقب الماسي لإنشاء ستة إلى سبعة أزواج من الثقوب على طول الحواف المتقابلة لشريحة زجاجية مقاس ثلاث بوصات × بوصة واحدة. عندما يتم حفر جميع الثقوب ، افركي الشريحة تحت الماء المتدفق لإزالة أي مسحوق زجاجي مرئي.

ضع الشرائح في وضع مستقيم في وعاء زجاجي واملأها بالماء المقطر. قم بتقطيع البرطمان لمدة 15 دقيقة ثم انقل الشرائح إلى وعاء زجاجي مخصص لتنظيف الأسيتون. املأ البرطمان بالأسيتون وصوتنة الشرائح في الأسيتون لمدة 15 دقيقة أخرى.

بعد ذلك ، قم برش الشرائح بالإيثانول ثم بالماء لشطفها ثم نقل الشرائح إلى وعاء بولي بروبلين. املأ جرة البولي بروبلين بخمسة هيدروكسيد بوتاسيوم مولار ثم صوتنة الشرائح لمدة 15 دقيقة أخرى بعد الغسيل الأخير ، واشطف الشرائح بالماء المقطر ، متبوعا ب 15 دقيقة أخرى. صوتنة ثم بعد تنظيف الغطاء.

بنفس الطريقة ، قم بتوزيع 80 ميكرولترا من محلول PEG الطازج على كل شريحة ، ثم قم بخفض زلة الغطاء برفق فوق الوتد. بعد 45 دقيقة ، استخدم الملقط لإزالة زلات الغطاء من الشرائح ، واشطف الشرائح وانزلق الغطاء بكمية وفيرة من الماء المقطر. ثم جففها في مكان مجفف عندما ينزلق الغطاء ويجف ، ضع شرائط رقيقة من الشريط اللاصق المزدوج عبر الشريحة لتشكيل قنوات ، وخط غطاء ينزلق فوق الشرائط واضغط بقوة على زلة الغطاء لتشكيل قنوات سائلة ضيقة.

ثم استخدم الايبوكسي لمدة خمس دقائق لإغلاق حواف القنوات لشل حركة الجزيئات للفحص المجهري. أولا ، قم بحقن 15 ميكرولترا من محلول النيو ترادين في قناة واحدة. بعد دقيقتين ، اشطف القناة ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت T 50 ثم قم بحقن 50 ميكرولتر من عينة الحمض النووي في القناة.

بعد خمس دقائق ، اشطف الحمض النووي غير المرتبط ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت T 50 ، ثم املأ القناة بمخزن مؤقت للتصوير يحتوي على نظام كسح الأكسجين. الآن ضع زيت الغاطس على هدف المجهر ، ثم استخدم مشابك العينة لتثبيت خلية التدفق على مرحلة المجهر. قم بتشغيل الليزر 532 نانومتر.

استخدم المنظر المباشر لصور الفلورسنت على الشاشة لصقلها. اضبط التركيز. ابدأ الحصول على البيانات باستخدام تشغيل الليزر 532 نانومتر.

أوقف الحصول على البيانات عندما يتم تبييض معظم الجزيئات بالصور لمعالجة الصور وتحليلها ، استخدم نص MATLAB للنظر في جميع آثار وقت الجزيء الفردي التي تظهر انتقالات متعددة بين إشارات الحنق العالية والمنخفضة. حدد الحالات الحلقية وغير الحلقية ، ثم أوجد العتبة التي تفصل بين التوزيعين عن طريق تحديد التقاطع بين المنحنيين الغوسيين المجهزين. بعد ذلك ، احسب الكفاءة الأمامية F بقسمة شدة الخيال العلمي على مجموع SCI ثلاثة وشدة الخيال العلمي.

تعيين حالات الحلقة ذات قيم الحنق العالية وحالات إلغاء التكرار ذات قيم الحنق المنخفضة. ثم باستخدام برنامج نصي MATLAB ، قم بتحليل العدد التراكمي للجزيئات أو NFT التي تم تكرارها ، أي التي وصلت إلى حالة الحنق العالي في فترات زمنية مختلفة. منذ بداية الحصول على البيانات ، يمكن بعد ذلك استخراج الحلقة الفرعية K لمعدل التكرار عن طريق تركيب NFT بوظيفة أسية.

إذا زاد NFT ثنائيا ، فيمكن تزويده بشكل أساسي بدالة أسية مزدوجة كما هو موضح في المعادلة. في هذه الحالة ، يتم الحصول على الحلقة الفرعية K من هذه المعادلة لتحديد تدفق عامل J. 20 ميكرولتر من 30 إلى 50 picaMolar biotin sci five oligo أو primer three في إحدى القنوات المطلية بالجوز travain كما هو موضح للتو.

بعد ذلك ، اشطف القناة ب 100 ميكرولتر من T 50 لغسل oligos غير المنضمة ، ثم قم بتدفق المخزن المؤقت للتصوير المعد حديثا مع PS three oligo في الغرفة. احتفظ بالليزر 532 نانومتر قيد التشغيل ثم قم بتشغيل الليزر 640 نانومتر لفترة وجيزة لتحديد مواقع أي أوليغوس خيال علمي مرتبط بالسطح. ثم قم بإيقاف تشغيل الليزر 640 نانومتر وابدأ في مراقبة إشارة الحنق.

استخدم نص MATLAB لتحليل عدد الجزيئات التي تبدأ في الحالة غير المرتبطة. هذا بكثافة علمية منخفضة ، ولكن يتحول لاحقا إلى حالة IL. أي مع كثافة علمية عالية كدالة للوقت من آثار شدة العلم رسم هذا العدد من جزيئات ane مقابل الوقت المناسب للمنحنى بوظيفة أسية واحدة للحصول على معدل الإيلينغ.

K sub anil ، كرر التجربة بتركيزات مختلفة من SI ثلاثة oligo لتأكيد الخطية بين معدل الركوع وتركيز المتفاعل. استخرج الدرجة الثانية ثابت معدل الركوع K أولي فرعي من المنحدر. أخيرا ، احسب عامل J حيث الحلقة الفرعية K هي معدل التكرار المقاس في نفس الظروف العازلة لاختبار تأثير الانحناء الجوهري للحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل على الحلقة.

في هذه التجربة ، زوج أساسي واحد مستقيم وواحد منحني 186. تم بناء كل من الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل مقارنة بالحمض النووي المستقيم. تم تحديد الحمض النووي المنحني لإنتاج المزيد من أحداث الحنق العالي خلال نفس الفترة الزمنية.

أن الحمض النووي المنحني يدور أربع مرات أكثر من الحمض النووي المستقيم خلال نفس وقت الاستحواذ ، مما يدل على أن الانحناء الجوهري للحمض النووي يمكن أن يؤثر بشكل كبير على ديناميكيات الحلقات. في خطوة التحليل النهائية هذه ، تم حساب عامل J بقسمة معدل التكرار على الترتيب الأول ، وهو ثابت معدل الركوع ، وتم تحديده على أنه 61 زائد أو ناقص ثلاثة مولر للحمض النووي المستقيم و 265 زائد أو ناقص 48 نانومولار للحمض النووي للمنحنى بالاتفاق مع النتائج السابقة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن دراسة تأثيرات عامل الحادث على الحركة الحلقية مثل درجة الحرارة وغير المجهدة واللزوجة.

سيكون هذا البروتوكول مفيدا ليس فقط لدراسة فيزياء البوليمر للحمض النووي ، ولكن أيضا لإظهار قوة مضان الجزيء الفردي لطلاب البحث المبتدئين أو الجمهور العادي.