Name: دراسة الحمض النووي عن طريق حلقات جزيء واحد الحنق (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: اكتشف ديناميكيات تكوين الحلقات في الحمض النووي المزدوج السلسلة باستخدام تقنية FRET للجزيء الواحد. تقيس هذه الطريقة احتمالية التكوين الحلقي بدون بروتينات ملزمة، مما يوفر رؤى دقيقة حول تشكيل الحمض النووي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر جيمس واترز، وادز ورث غيبل وبو برودواتر لقراءة نقدية للمخطوطة. نشكر أيضا أربعة المراجعين المجهولين لتوفير تعليقات مفيدة. نحن نعترف الدعم المالي من معهد جورجيا للتكنولوجيا، وجائزة صندوق ويلكوم بوروز الوظيفي في واجهة العلمي، ومنحة شبكة البحوث طالب من جبهة الخلاص الوطني الفيزياء نظم المعيشة.

<ol><li>Garcia, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+consequences+of+tightly+bent+DNA%3A+The+other+life+of+a+macromolecular+celebrity%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Biological consequences of tightly bent DNA: The other life of a macromolecular celebrity.</a> Biopolymers. 85, 115-130 (2007).</li>
<li>Wiggins, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+flexibility+of+DNA+on+short+length+scales+probed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">High flexibility of DNA on short length scales probed by atomic force microscopy.</a> Nature Nanotechnology. 1, (2006).</li>
<li>Lionberger, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+kinking+at+distant+sites+in+mechanically+stressed+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cooperative kinking at distant sites in mechanically stressed DNA.</a> Nucleic Acids Research. 41, 6785-6792 (2011).</li>
<li>Shore, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+flexibility+studied+by+covalent+closure+of+short+fragments+into+circles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">DNA flexibility studied by covalent closure of short fragments into circles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 4833-4837 (1981).</li>
<li>Geggier, S., Vologodskii, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+dependence+of+DNA+bending+rigidity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Sequence dependence of DNA bending rigidity.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 107, 15421-15426 (1992).</li>
<li>Smith, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+mechanical+measurements+of+the+elasticity+of+single+DNA+molecules+by+using+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads.</a> Science. 258, 1122-1126 (1992).</li>
<li>Peters, J. P., Maher, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+curvature+and+flexibility+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">DNA curvature and flexibility in vitro and in vivo.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 43, 23-63 (2010).</li>
<li>Cloutier, T. E., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+sharp+bending+of+double-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous sharp bending of double-stranded DNA.</a> Molecular Cell. 14, 355-362 (2004).</li>
<li>Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclization+of+short+DNA+fragments+and+bending+fluctuations+of+the+double+helix%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cyclization of short DNA fragments and bending fluctuations of the double helix.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 5397-5402 (2005).</li>
<li>Yuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T4+DNA+ligase+is+more+than+an+effective+trap+of+cyclized+dsDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">T4 DNA ligase is more than an effective trap of cyclized dsDNA.</a> Nucl. Acids Res. 35, 5294-5302 (2007).</li>
<li>Manzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+nonspecific+binding+of+lambda+repressor+on+DNA+looping+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The effect of nonspecific binding of lambda repressor on DNA looping dynamics.</a> Biophysical Journal. 103, 1753-1761 (2012).</li>
<li>Le, T. T., Kim, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+shape-dependent+looping+probability+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measuring shape-dependent looping probability of DNA.</a> Biophys. J. 104, 2068-2076 (2013).</li>
<li>Vafabakhsh, R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+bendability+of+DNA+less+than+100+base+pairs+long+revealed+by+single-molecule+cyclization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extreme bendability of DNA less than 100 base pairs long revealed by single-molecule cyclization.</a> Science. 337, 1097-1101 (2012).</li>
<li>Friedman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viewing+dynamic+assembly+of+molecular+complexes+by+multi-wavelength+single-molecule+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence.</a> Biophysical Journal. 91, 1023-1031 (2006).</li>
<li>Kaplan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-encoded+nucleosome+organization+of+a+eukaryotic+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome.</a> Nature. 458, 362-366 (2009).</li>
<li>Koo, H. S., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+DNA+curvature+and+a+unified+description+of+sequence-directed+bending%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Calibration of DNA curvature and a unified description of sequence-directed bending.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 85, 1763-1767 (1988).</li>
<li>Prosseda, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+temperature-induced+narrow+DNA+curvature+range+sustains+the+maximum+activity+of+a+bacterial+promoter+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A temperature-induced narrow DNA curvature range sustains the maximum activity of a bacterial promoter in vitro.</a> Biochemistry. 49, 2778-2785 (2010).</li>
<li>Rasnik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3, 891-893 (2006).</li>
<li>Cordes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+Trolox+as+antiblinking+and+antibleaching+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 5018-5019 (2009).</li>
<li>Aitken, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).</li>
<li>Taylor, W. H., Hagerman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+method+of+phage+T4+DNA+ligase-catalyzed+ring-closure+to+the+study+of+DNA+structure%3A+II.+NaCl-dependence+of+DNA+flexibility+and+helical+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Application of the method of phage T4 DNA ligase-catalyzed ring-closure to the study of DNA structure: II. NaCl-dependence of DNA flexibility and helical repeat.</a> Journal of Molecular Biology. 212, 363-376 (1990).</li>
<li>Bolshoy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curved+DNA+without+A-A%3A+experimental+estimation+of+all+16+DNA+wedge+angles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Curved DNA without A-A: experimental estimation of all 16 DNA wedge angles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 2312-2316 (1991).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+DNA+fragments+in+yeast+by+one-step+assembly+of+overlapping+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides.</a> Nucl. Acids Res. 37, 6984-6990 (2009).</li>
<li>Vologodskii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+of+short+DNA+helices%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+DNA+PNA+XNA%22%5BJournal%5D)">Bending of short DNA helices.</a> Artif DNA PNA XNA. 4, (2013).</li>
<li>Hoover, D. M., Lubkowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNAWorks%3A+an+automated+method+for+designing+oligonucleotides+for+PCR-based+gene+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis.</a> Nucl. Acids Res. 30, (2002).</li>
<li>Waters, J. T., Kim, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrium+Statistics+of+a+Surface-Pinned+Semiflexible+Polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Equilibrium Statistics of a Surface-Pinned Semiflexible Polymer.</a> Macromolecules. 46, 6659-6666 (2013).</li>
<li>Mills, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+evidence+that+single-stranded+regions+of+1+or+more+nucleotides+dramatically+increase+the+flexibility+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic evidence that single-stranded regions of 1 or more nucleotides dramatically increase the flexibility of DNA.</a> Biochemistry. 33, 1797-1803 (1994).</li>
</ol>

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

واستخدمت مقايسة بسيطة جزيء واحد يعتمد على الحنق لدراسة حركية حلقات من السلطات الوطنية المعينة من الأشكال الجوهرية المختلفة. يمكن السلطات الوطنية المعينة منحني بتكرار تسلسل 10 مير في مرحلة مع الفترة حلزونية من 10.5 نقطة أساس على استعداد، ويمكن تقدير الانحرافات الخاصة بهم باستخدام PAGE. وقد صممت هذه dsDNAs مع نهايات لزجة للسماح الاستقرار حلقة عابرة. استخرجنا معدل حلقات من الارتفاع الهائل في عدد الجزيئات يحلق مع مرور الوقت. يتم استخدام معدل ثابت الصلب بين قطع شرائح نهاية لزجة لتحديد ...

فهم الخواص الميكانيكية للdsDNA وغير ذات أهمية أساسية في العلوم الأساسية والتطبيقات الهندسية. هيكل dsDNA وأكثر تعقيدا من سلم حلزوني على التوالي بسبب زوايا لفة، والميل، وتطور بين أزواج قاعدة المتعاقبة يمكن أن تختلف مع التسلسل. يمكن أن تسبب التقلبات الحرارية dsDNA والخضوع وسائط متنوعة من تقلبات بتكوين مثل الانحناء، واللف والتمدد. التحولات مثل ذوبان ومجعد يمكن أن يحدث أيضا في الظروف القاسية. من بين هذه الاقتراحات، dsDNA والانحناء له الأثر البيولوجي أكثر ما يلفت الانتباه 1. ويرتبط dsDNA والانحناء مع القمع الجينات أو التنشيط من خلال جلب اثنين من مواقع بعيدة قريبة من بعضها البعض. كما أنها تلعب دورا هاما في التعبئة و التغليف الحمض النووي داخل نواة الخلية أو قفيصة الفيروسية. الانحناء تشوه dsDNA ويمكن تصور تجريبيا بواسطة عالية الدقة المجهر (AFM 2 و 3 TEM)، وthermodynamics وحركية يمكن دراستها بواسطة حلقات المقايسات، التي تربط كيميائيا المواقع جنبا إلى جنب من dsDNA و. واحدة من هذه الاختبار هو تعتمد على يغاز سيكليزيشن 4. في هذا الاختبار، يتم circularized جزيئات dsDNA ومع &quot;لزجة&quot; (متماسكة) أو نهايات dimerized بواسطة يغاز الحمض النووي. من خلال مقارنة معدلات دائرة وتشكيل ديمر، يمكن للمرء الحصول على التركيز المولي الفعلي لنهاية واحدة من الحمض النووي في محيط الطرف الآخر، والذي يعرف باسم عامل J. هذا العامل J ما يعادل الأبعاد لكثافة احتمال العثور على واحدة نهاية من الحمض النووي على مسافة قصيرة من الطرف الآخر، وبالتالي يعكس المرونة من الحمض النووي. قياس عامل J بوصفها وظيفة من طول الحمض النووي يكشف خصائص كثيرة عن ميكانيكا الحمض النووي بما في ذلك طول استمرار 4،5. فقد كان ينظر على نطاق واسع سلسلة مثل دودة (WLC) نموذج كنموذج البوليمر الكنسي للميكانيكيين dsDNA وبناء على نجاحها في تفسيراining منحنيات القوة والإرشاد في الحمض النووي التي تم الحصول عليها سحب تجارب 6، وتوقع بشكل صحيح العوامل J من dsDNAs أطول من 200 سنة مضت 7. ومع ذلك، باستخدام مقايسة سيكليزيشن على جزيئات dsDNA وقصيرة بقدر 100 سنة مضت، ويدوم كلوتير وقياس العوامل J أن تكون عدة أوامر من حجم أعلى من التنبؤ WLC نموذج 8. وبعد ذلك بعام، دو وآخرون. أنتج عوامل J بالاتفاق مع نموذج WLC باستخدام مقايسة سيكليزيشن مع تركيزات أقل من يغاز وعزا نتيجة الشاذة من مجموعة ويدوم لتركيزات عالية تستخدم يغاز 9. هذا الجدل تجسد تأثير لا مفر منه من يغاز الحمض النووي على حركية سيكليزيشن عند استخدام الفحص التقليدية 9. علاوة على ذلك، يمكن أن تؤثر أيضا على الحمض النووي يغاز بنية الحمض النووي وصلابة عن طريق غير محددة 10،11 ملزمة. للقضاء على المخاوف من المقايسات الفنية التي تعتمد على البروتين حلقات، أثبتنا مؤخرا البروتوكول الاضافيعين خالية مقايسة حلقات على أساس نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق) 12. في هذه الطريقة، يتم الكشف عن التشكل يحلق بواسطة الحنق بين المانحين ومتقبل تعلق بالقرب من نهايات لزجة من جزيء الحمض النووي. يستخدم هدفا من نوع مجموع المجهر مضان التأمل الداخلي (TIRFM) لتسجيل مسارات حلقات عكسها والأحداث unlooping من جزيئات الحمض النووي واحد يجمد السطح لفترة طويلة من الزمن. يتميز هذا الأسلوب التجمع PCR القائم من جزيئات الحمض النووي لتوليد جزيئات الحمض النووي خالية من عدم التوافق، وهو تحسن حاسم على أسلوب مماثل من قبل Vafabakhsh وها 13. على جانب واحد جزيء من هذا البروتوكول يسمح قياس توزيعات بالإضافة إلى فرقة المتوسطات في حين أن الجانب الحنق يسمح احد لقياس ديناميكية حلقات الحمض النووي مرارا وتكرارا من نفس الجزيء، حتى في الظروف التي يمكن أن يضعف النشاط يغاز. يظهر الإعداد TIRFM في الشكل رقم 1. A مخصصةيتم وضع تصميم المرحلة العينة على هيئة المجهر أوليمبوس IX61. يتم إدخال 532 نانومتر و 640 نانومتر ليزر من الجانب والتي تعكسها المرايا بيضاوي الشكل صغيرة 14 من زمن الهدف NA عالية لتحقيق زاوية حرجة من الإصابة في واجهة المياه ساترة. نلاحظ أن أكثر انتشارا النقل البري الدولي من خلال الهدف باستخدام المرايا مزدوج اللون أو الاجهزة النقل البري الدولي القائم على منظور يمكن أن تستخدم أيضا لهذا التطبيق الحنق. يتم تقسيم الصورة التي شكلتها مضان المجهر في الصور المانحة ومتقبل بواسطة مرآة مزدوج اللون. ثم يتم إعادة تصويرها، فهم على نصفين من EMCCD. وتستخدم مرشحات إضافية الانبعاثات تمريرة طويلة للحد من إشارة الخلفية. التحكم في درجة الحرارة أمر ضروري للحصول على البيانات الحركية استنساخه. لمراقبة درجة الحرارة، ويتم فصل الهدف من الأنفية من الجسم المجهر لتقليل انتقال الحرارة، والماء من درجة الحرارة التي تسيطر عليها المبرد / سخان يعمم من خلال طوق النحاس أن يناسب بإحكامحول المعدنية الداخلية تحت سترة الهدف. هذا الإعداد هو قادرة على تحقيق التحكم في درجة الحرارة قوية على السطح ساترة بين 15 و 50 درجة مئوية (الشكل 2). في هذا العمل، والحفاظ على درجة حرارة العينة في 24 درجة مئوية. ويقدم البروتوكول باتباع الإجراء خطوة بخطوة لبناء الحمض النووي، وتقدير شكل الحمض النووي، وتجربة واحدة جزيء، وJ تحديد عامل.

<table><tbody><tr><td>مجموعة مستخلص الحمض النووي FRAG الصغيرة - 100PR</td><td>VWR</td><td>97060-558</td><td></td></tr><tr><td>محلول أكريلاميد 40٪ 500 مل</td><td>VWR</td><td>97064-522</td><td></td></tr><tr><td>ثنائي أكريلاميد 2٪ (وزن / حجم) محلول 500 مل</td><td>VWR</td><td>97063-948</td><td></td></tr><tr><td>سلم الحمض النووي GeneRuler 100 نقطة أساس ، 100-1،000 نقطة أساس</td><td>Fermentas</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>نظام الصفحة العمودي الصغير</td><td>VWR</td><td>89032-300</td><td></td></tr><tr><td>مرشح حقنة 0.2 & م CS50</td><td>VWR</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813-1G</td><td>مروي الحالة الثلاثية</td></tr><tr><td>حمض Protocatechuic (PCA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>08992-50MG</td><td>نظام كسح الأكسجين</td></tr><tr><td>Protocatechuate 3،4-Dioxygenase (PCD)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8279-25UN</td><td>نظام كسح الأكسجين</td></tr><tr><td>mPEG-silane ، MW 2،000 1 g</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SIL-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-Silane ، MW 3,400</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SIL-3400-1g</td><td></td></tr><tr><td>Avidin ، NeutrAvidin Biotin-Binding Protein</td><td>Invitrogen</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start عالي الدقة DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>F-540L</td><td></td></tr><tr><td>Gel / PCR طقم استخراج شظايا الحمض</td><td>النووي IBI Scientific</td><td>IB47020</td><td></td></tr><tr><td>شرائح مجهر زجاجي عادي ممتاز</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>VWR زجاج غطاء صغير ، مستطيل ، رقم 1</td><td>VWR</td><td>48404-456</td><td></td></tr><tr><td>فيشر Scientific Isotemp 1006S مبرد / سخان</td><td>فيشر التحكم العلمي</td><td></td><td>في درجة الحرارة</td></tr><tr><td>طوق التبريد الموضوعي</td><td>Bioptechs</td> التحكم <td>في درجة الحرارة</td><td></td></tr><tr><td>150303 KMI53 البيولوجي مرحلة قياس الميكرومتر</td><td>Semprex</td><td>KMI53</td><td></td></tr><tr><td>ليزر DPSS عالي الأداء 532 نانومتر 50 ميغاواط</td><td>بصريات إدموند</td><td>NT66-968</td><td>Cy3 إثارة</td></tr><tr><td>مكعب الألياف ضفيرة 640 نانومتر ، 30 ميغاواط ، ألياف ، موصل FC / APC</td><td>متماسك</td><td>1139604</td><td>إثارة Cy5</td></tr><tr><td>650 نانومتر BrightLine ثنائي اللون Beamsplitter</td><td>Semrock</td><td>FF650-Di01-25x36</td> تقسيم <td>ثنائي اللون</td></tr><tr><td>LaserMUX Beam Combiner ، يعكس 514.5 و 532 و ليزر 543.5 نانومتر ، 25 مم</td><td>Semrock</td><td>LM01-552-25</td><td>يجمع بين</td></tr><tr><td>مرشح مضان Brightline ثنائي اللون 593/40</td><td>Semrock</td><td>FF01-593 / 40-25</td><td>مرشح انبعاث Cy3</td></tr><tr><td>635 نانومتر EdgeBasic LWP مرشح ممر طويل ، 25 مم</td> مرشح <td>انبعاث</td><td>Semrock</td><td>BLP01-635R-25</td> Cy5</tr><tr><td>EMCCD iXon +</td> <td>Andor Technology</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>IX51 إطار مجهر مقلوب</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective UApo N 100X / 1.49 زيت TIRF</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>زيت الغمر من النوع F للفحص المجهري الفلوري</td><td>أوليمبوس</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>2 مم قطر 45 درجة ؛ قضيب عدسة الألومنيوم المغلفة&nbsp;</td><td>بصريات إدموند</td><td>54-092</td><td>مرآة مصغرة</td></tr><tr><td>1/4 "مرحلة ترجمة أحادية المحور للسفر</td><td>Thorlabs</td><td>MS-1</td><td>ترجمة مرآة مصغرة</td></tr> <tr><td>& Oslash ؛ 1 "مزدوج لوني ، ARC: 400-700 نانومتر ، f = 200 مم</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-200-A</td><td>عدسة تركيز</td></tr><tr><td>ميكانيكية قابلة للتعديل</td><td>شق Thorlabs</td><td>VA100</td><td></td></tr><tr><td>مرآة عازلة</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E02</td><td></td></tr> <tr><td>& Oslash ؛ 1 "مزدوج لوني ، f = 100 مم</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A</td><td>عدسة مرحل</td></tr><tr><td>حامل عدسة ل & Oslash ؛ 1 "بصريات</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1</td><td></td></tr><tr><td>ثنائي اللون مرشح جبل</td><td>Thorlabs</td><td>FFM1</td><td></td></tr><tr><td>منصة مكعب القفص الثابت</td><td>Thorlabs</td><td>B3C</td><td></td></tr><tr><td>جبل حركي ل & 1 "بصريات</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td></td></tr><tr><td>N-BK7 عدسة بلانو محدبة ، & Oslash ؛ 1 "، f = 40 مم</td><td>Thorlabs</td><td>LA1422-A</td><td>عدسة موازية</td></tr><tr><td>N-BK7 Plano-Convex Lense ، & Oslash ؛ 6.0 مم ، f = 15 مم</td><td>Thorlabs</td><td>LA1222-A</td><td>عدسة تلسكوب</td></tr><tr><td>N-BK7 Plano-Convex Lense ، & Oslash ؛ 6.0 مم ، f = 150 مم</td><td>عدسة تلسكوب</td> <td>Thorlabs</td><td>LA1433-A</td></tr></tbody></table>

دراسة الحمض النووي عن طريق حلقات جزيء واحد الحنق

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

الانحناء من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل (dsDNA و) ويرتبط مع العديد من العمليات البيولوجية الهامة مثل التعرف على الحمض النووي والبروتينات والحمض النووي في التعبئة والتغليف Nucleosomes لل. وقد تمت دراسة الديناميكا الحرارية من dsDNA والانحناء بطريقة تسمى سيكليزيشن التي تعتمد على الحمض النووي يغاز للانضمام تساهميا نهايات لزجة قصيرة من dsDNA و. ومع ذلك، يمكن أن تتأثر كفاءة ربط العديد من العوامل التي لا ترتبط dsDNA وحلقات مثل بنية الحمض النووي المحيطة نهايات لزجة انضم، ويغاز يمكن أن يؤثر أيضا على معدل حلقات اضحا من خلال آليات مثل الربط غير محددة. هنا، وتبين لنا كيفية قياس حركية dsDNA وحلقات من دون يغاز عن طريق الكشف عابرة تشكيل حلقة الحمض النووي عن طريق الحنق (الإسفار الرنين نقل الطاقة). هي التي شيدت جزيئات dsDNA وباستخدام بروتوكول بسيطة PCR القائم مع زوج الحنق ورابط البيوتين. يتم استخراج كثافة الاحتمال حلقات المعروفة باسم عامل J من معدل حلقات ومعدل الصلب بين اثنين disconnecتيد نهايات لزجة. عن طريق اختبار اثنين dsDNAs مع الانحرافات الجوهرية المختلفة، وتبين لنا أن العامل J حساسة لشكل جوهري من dsDNA و.

تتكون جزيئات الحمض النووي المستخدمة في الدراسة حلقات من المنطقة المزدوجة من تسلسل متغير وطول واحد يتدلى الذين تقطعت بهم السبل التي هي مكملة لبعضها البعض. ويتدلى، والتي هي 7 قاعدة طويلة، يمكن أن يصلب مع بعضها البعض لالتقاط حالة يحلق. كل عبء يحتوي إما CY3 أو Cy5 مرتبط في العمود الفقري الحمض النووي من خلال الكيمياء amidite. يرتبط Cy5-عبء أيضا مع البيوتين-TEG (15 ذرة رباعي جلايكول الإثيلين هل) لتجميد السطحية (انظر الشكل 4A). ويمكن إدراج كل هذه التعديلات في dsDNA وبعد ...

تقدم هذه الدراسة إجراء التجارب مفصلة لقياس ديناميكية حلقات من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل باستخدام جزيء واحد نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق). يصف البروتوكول أيضا كيفية استخراج كثافة الاحتمال حلقات يسمى عامل J.

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

الهدف العام من التجربة التالية هو التحقيق في كيفية تأثر ديناميكيات الحلقات للحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل بالشكل الجوهري للحمض النووي دون استخدام بروتينات ربط الحمض النووي. يتم تحقيق ذلك عن طريق دمج جزيئات الصبغة في شظايا الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بهم السبل ذات انحناءات مختلفة بحيث يمكن مراقبة حلقات الحمض النووي عن طريق رنين التألق أو نقل الطاقة أو الحنق. يمكن بعد ذلك ملاحظة أحداث الحلقات القابلة للانعكاس وأحداث التكرار من جزيئات الحمض النووي المفردة عن طريق الفحص المجهري للانعكاس الداخلي الكلي.يمكن بعد ذلك استقراء معدل تكرار الحمض النووي من المسارات الزمنية لكل جزيء مضان على حدة. في النهاية ، يمكن قياس احتمالية تكرار الحمض النووي فيما يتعلق بالشكل الجوهري للجزء. الميزة الرئيسية لمقايسة حلقات الحمض النووي هذه هي أنه لا يعتمد على بروتين ربط الحمض النووي ، والذي قد يؤثر على حركية التكرار للحمض النووي.يدور البروتوكول البسيط حول استخدام تقنية تسمى نقل طاقة الرنين الفلوري ، وتوليف الحمض النووي القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). لقياس احتمالية بحث الحمض النووي ، ابدأ بتصميم الحمض النووي المنحني عالميا عن طريق تكرار تسلسل 10 MER. على سبيل المثال ، هذا التسلسل التمثيلي هو 186 زوجا أساسيا من الحمض النووي المنحني ، حيث X عبارة عن قاعدة إضافية عشوائية والتسلسلات التي تحيط بتسلسل 10 mers المتكرر هي تسلسلات محول.بعد ذلك ، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات الأول والثاني باستخدام المتبرع الحنق SI ثلاثة وضع العلامات على التمهيدي الثاني في النهاية الأولية الخمسة. ثم قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات الثالثة والرابعة مع متقبل الحنق SCI خمسة وضع العلامات من خلال العمود الفقري ورابط البيوتين في الطرف الخامس الرئيسي من التمهيدي الثالث. بعد تنقية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعة تنظيف PCR ، امزج المنتجات المصابة بثلاثة SCI والمنتجات ذات العلامات الخمسة SCI في مخزن مؤقت لتبادل الخيوط بتركيزات نهائية تبلغ 0.4 ميكرومولار و 0.1 ميكرومولار على التوالي.ثم احتضان الخيوط عند 98.5 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، مع التبريد التدريجي إلى خمس درجات مئوية بمعدل منحدر 0.1 درجة مئوية في الثانية ، ثم تحتضن عند خمس درجات مئوية لمدة ساعتين. لتبادل الخيوط لإعداد خلية التدفق ، استخدم مكبس الحفر ولقم الثقب الماسي لإنشاء ستة إلى سبعة أزواج من الثقوب على طول الحواف المتقابلة لشريحة زجاجية مقاس ثلاث بوصات × بوصة واحدة. عندما يتم حفر جميع الثقوب ، افركي الشريحة تحت الماء المتدفق لإزالة أي مسحوق زجاجي مرئي.ضع الشرائح في وضع مستقيم في وعاء زجاجي واملأها بالماء المقطر. قم بتقطيع البرطمان لمدة 15 دقيقة ثم انقل الشرائح إلى وعاء زجاجي مخصص لتنظيف الأسيتون. املأ البرطمان بالأسيتون وصوتنة الشرائح في الأسيتون لمدة 15 دقيقة أخرى.بعد ذلك ، قم برش الشرائح بالإيثانول ثم بالماء لشطفها ثم نقل الشرائح إلى وعاء بولي بروبلين. املأ جرة البولي بروبلين بخمسة هيدروكسيد بوتاسيوم مولار ثم صوتنة الشرائح لمدة 15 دقيقة أخرى بعد الغسيل الأخير ، واشطف الشرائح بالماء المقطر ، متبوعا ب 15 دقيقة أخرى. صوتنة ثم بعد تنظيف الغطاء.بنفس الطريقة ، قم بتوزيع 80 ميكرولترا من محلول PEG الطازج على كل شريحة ، ثم قم بخفض زلة الغطاء برفق فوق الوتد. بعد 45 دقيقة ، استخدم الملقط لإزالة زلات الغطاء من الشرائح ، واشطف الشرائح وانزلق الغطاء بكمية وفيرة من الماء المقطر. ثم جففها في مكان مجفف عندما ينزلق الغطاء ويجف ، ضع شرائط رقيقة من الشريط اللاصق المزدوج عبر الشريحة لتشكيل قنوات ، وخط غطاء ينزلق فوق الشرائط واضغط بقوة على زلة الغطاء لتشكيل قنوات سائلة ضيقة.ثم استخدم الايبوكسي لمدة خمس دقائق لإغلاق حواف القنوات لشل حركة الجزيئات للفحص المجهري. أولا ، قم بحقن 15 ميكرولترا من محلول النيو ترادين في قناة واحدة. بعد دقيقتين ، اشطف القناة ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت T 50 ثم قم بحقن 50 ميكرولتر من عينة الحمض النووي في القناة.بعد خمس دقائق ، اشطف الحمض النووي غير المرتبط ب 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت T 50 ، ثم املأ القناة بمخزن مؤقت للتصوير يحتوي على نظام كسح الأكسجين. الآن ضع زيت الغاطس على هدف المجهر ، ثم استخدم مشابك العينة لتثبيت خلية التدفق على مرحلة المجهر. قم بتشغيل الليزر 532 نانومتر.استخدم المنظر المباشر لصور الفلورسنت على الشاشة لصقلها. اضبط التركيز. ابدأ الحصول على البيانات باستخدام تشغيل الليزر 532 نانومتر.أوقف الحصول على البيانات عندما يتم تبييض معظم الجزيئات بالصور لمعالجة الصور وتحليلها ، استخدم نص MATLAB للنظر في جميع آثار وقت الجزيء الفردي التي تظهر انتقالات متعددة بين إشارات الحنق العالية والمنخفضة. حدد الحالات الحلقية وغير الحلقية ، ثم أوجد العتبة التي تفصل بين التوزيعين عن طريق تحديد التقاطع بين المنحنيين الغوسيين المجهزين. بعد ذلك ، احسب الكفاءة الأمامية F بقسمة شدة الخيال العلمي على مجموع SCI ثلاثة وشدة الخيال العلمي.تعيين حالات الحلقة ذات قيم الحنق العالية وحالات إلغاء التكرار ذات قيم الحنق المنخفضة. ثم باستخدام برنامج نصي MATLAB ، قم بتحليل العدد التراكمي للجزيئات أو NFT التي تم تكرارها ، أي التي وصلت إلى حالة الحنق العالي في فترات زمنية مختلفة. منذ بداية الحصول على البيانات ، يمكن بعد ذلك استخراج الحلقة الفرعية K لمعدل التكرار عن طريق تركيب NFT بوظيفة أسية.إذا زاد NFT ثنائيا ، فيمكن تزويده بشكل أساسي بدالة أسية مزدوجة كما هو موضح في المعادلة. في هذه الحالة ، يتم الحصول على الحلقة الفرعية K من هذه المعادلة لتحديد تدفق عامل J. 20 ميكرولتر من 30 إلى 50 picaMolar biotin sci five oligo أو primer three في إحدى القنوات المطلية بالجوز travain كما هو موضح للتو.بعد ذلك ، اشطف القناة ب 100 ميكرولتر من T 50 لغسل oligos غير المنضمة ، ثم قم بتدفق المخزن المؤقت للتصوير المعد حديثا مع PS three oligo في الغرفة. احتفظ بالليزر 532 نانومتر قيد التشغيل ثم قم بتشغيل الليزر 640 نانومتر لفترة وجيزة لتحديد مواقع أي أوليغوس خيال علمي مرتبط بالسطح. ثم قم بإيقاف تشغيل الليزر 640 نانومتر وابدأ في مراقبة إشارة الحنق.استخدم نص MATLAB لتحليل عدد الجزيئات التي تبدأ في الحالة غير المرتبطة. هذا بكثافة علمية منخفضة ، ولكن يتحول لاحقا إلى حالة IL. أي مع كثافة علمية عالية كدالة للوقت من آثار شدة العلم رسم هذا العدد من جزيئات ane مقابل الوقت المناسب للمنحنى بوظيفة أسية واحدة للحصول على معدل الإيلينغ.K sub anil ، كرر التجربة بتركيزات مختلفة من SI ثلاثة oligo لتأكيد الخطية بين معدل الركوع وتركيز المتفاعل. استخرج الدرجة الثانية ثابت معدل الركوع K أولي فرعي من المنحدر. أخيرا ، احسب عامل J حيث الحلقة الفرعية K هي معدل التكرار المقاس في نفس الظروف العازلة لاختبار تأثير الانحناء الجوهري للحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل على الحلقة.في هذه التجربة ، زوج أساسي واحد مستقيم وواحد منحني 186. تم بناء كل من الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل مقارنة بالحمض النووي المستقيم. تم تحديد الحمض النووي المنحني لإنتاج المزيد من أحداث الحنق العالي خلال نفس الفترة الزمنية.كما أن الحمض النووي المنحني يدور أربع مرات أكثر من الحمض النووي المستقيم خلال نفس وقت الاستحواذ ، مما يدل على أن الانحناء الجوهري للحمض النووي يمكن أن يؤثر بشكل كبير على ديناميكيات الحلقات. في خطوة التحليل النهائية هذه ، تم حساب عامل J بقسمة معدل التكرار على الترتيب الأول ، وهو ثابت معدل الركوع ، وتم تحديده على أنه 61 زائد أو ناقص ثلاثة مولر للحمض النووي المستقيم و 265 زائد أو ناقص 48 نانومولار للحمض النووي للمنحنى بالاتفاق مع النتائج السابقة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن دراسة تأثيرات عامل الحادث على الحركة الحلقية مثل درجة الحرارة وغير المجهدة واللزوجة.سيكون هذا البروتوكول مفيدا ليس فقط لدراسة فيزياء البوليمر للحمض النووي ، ولكن أيضا لإظهار قوة مضان الجزيء الفردي لطلاب البحث المبتدئين أو الجمهور العادي.

studying-dna-looping-by-single-molecule-fret

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يوضح هذا البروتوكول بسيطة المجهري مضان المفرد جزيء تقنية لتصور تكرار الحمض النووي التي replisomes الفردية في الوقت الحقيقي.

تصور تكرار الحمض النووي جزيء واحدة مع مضان المجهري

نحن تصف طريقة لمراقبة حقيقية تكرار وقت جزيئات الحمض النووي الفردية بوساطة بروتينات للنظام عاثية تكرارها.

الملاحظة المباشرة من الحمض النووي الانزيمات تكرار استخدام الحمض النووي جزيء واحدة تمتد الفحص

نحن هنا وصف الأدوات والأساليب للكشف عن جزيئات البروتين وحيد fluorescently المسمى-التفاعل مع جزيء DNA واحدة معلقة بين اثنين المجهرية المحاصرين بصريا.

الجمع بين التلاعب جزيء واحدة والتصوير لدراسة التفاعلات-DNA البروتين

ويبين هذا البروتوكول مقايسة تمتد تدفق جزيء واحد بسيطة وقوية وعالية إنتاجية لدراسة نشرها (1-د) أحادي الأبعاد للجزيئات على طول الحمض النووي.

جزيء واحد بسيطة وقوية وعالية إنتاجية تدفق تمتد مقايسة التنفيذ لدراسة نقل جزيئات على طول الحمض النووي

نقدم هنا، بروتوكولا لوصف الجسيمات نوكليوسومي على مستوى جزيء مفرد باستخدام مجهر القوة الذرية ثابتة والوقت الفاصل بين (فؤاد) تقنيات التصوير. يسمح أسلوب الروغان السطحية ووصف للقبض على بنية وديناميات nucleosomes في الاستبانة في النانو.

سبر بنية وديناميات Nucleosomes استخدام Imaging مجهر القوة الذرية

هنا ، نصف استخدام طريقة التصوير أحادية الجزيء ، ستائر الحمض النووي ، لدراسة الآلية الفيزيائية الحيوية لمكثفات EWS-FLI1 المتجمعة على الحمض النووي.

التصوير أحادي الجزيء لتجميع مكثفات EWS-FLI1 على الحمض النووي

تقدم هذه المقالة إجراء تجريبيا مفصلا لإعادة تكوين حبال الحمض النووي المحتوية على النيوكليوسوم للقوة المترابطة أحادية الجزيء والفحص المجهري الفلوري. كما يصف العديد من التجارب النهائية التي يمكن إجراؤها لتصور سلوك الربط للبروتينات المتفاعلة مع الكروماتين وتحليل التغيرات في الخصائص الفيزيائية للنيوكليوسومات.

تجميع النيوكليوسوم في الموقع للقوة الترابطية أحادية الجزيء والفحص المجهري الفلوري

يوضح هذا البروتوكول إجراء اختبار أحادي الجزيء للتصور المباشر لفك الحمض النووي بواسطة CMG helicase. يصف (1) تحضير ركيزة الحمض النووي ، (2) تنقية ذبابة الفاكهة السوداء CMG helicase المسمى بالفلورسنت ، (3) إعداد خلية تدفق الموائع الدقيقة للفحص المجهري للانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) ، و (4) مقايسة فك الحمض النووي أحادي الجزيء.

تصور أحادي الجزيء في الوقت الحقيقي لفك الحمض النووي بواسطة CMG Helicase

يحدد هذا البروتوكول مقايسة تكرار الحمض النووي أحادي الجزيء القائم على الفحص المجهري الفلوري ، مما يتيح التصور في الوقت الفعلي للتفاعلات بين بوليميرات الحمض النووي والعقبات مثل هياكل G-quadruplex.

تصور مضان أحادي الجزيء لديناميكيات بوليميراز الحمض النووي في G-Quadruplexes

وينظم الغشاء ظيفة البروتين الدهني من تكوين غشاء الخلية. تفاصيل هذا الفيديو المقالة كيفية تشكيل التصحيح باستخدام طبقة ثنائية الأقطاب التصحيح ، فضلا عن كيفية استخدام القنوات غراميسيدين وصحفيين من خصائص الغشاء تغييرها.

طرق جزيء واحد لرصد التغيرات في خصائص طبقة ثنائية مطاطا

اكتشف ديناميكيات تكوين الحلقات في الحمض النووي المزدوج السلسلة باستخدام تقنية FRET للجزيء الواحد. تقيس هذه الطريقة احتمالية التكوين الحلقي بدون بروتينات ملزمة، مما يوفر رؤى دقيقة حول تشكيل الحمض النووي.

دراسة الحمض النووي عن طريق حلقات جزيء واحد الحنق

استكشف المزيد من الفيديوهات