اللسان الإلكترونية توليد أنماط الاعتراف المستمر لتحليل البروتين
سبتمبر 16, 2014
الهدف العام من التجربة التالية هو بناء لسان إلكتروني يعتمد على نهج توافقي وإجراء تصوير البلازما والرنين السطحي لتحليل البروتين. يتم تحقيق ذلك باستخدام اللاكتوز واللاكتوز الكبريتات ككتلات بناء وترسيب مخاليطها على سطح الذهب للمنشور للتجميع الذاتي لإنشاء مجموعة من المستقبلات التوافقية التفاعلية. كسطح للخطوة الثانية ، يتم تطبيق تصوير البلازما والرنين ، والذي يراقب أحداث الربط في الوقت الفعلي وينتج صور SPR وسلسلة من منحنيات الربط الحركية تسمى جرامات المستشعر.
تتم معالجة البيانات التالية بناء على جرامات المستشعر باستخدام برنامج حوسبة رياضي من أجل إنشاء ملف تعريف تطور مستمر ثنائي الأبعاد ومشهد تطور مستمر ثلاثي الأبعاد لكل عينة ، وتظهر النتائج أن اللسان الإلكتروني قادر على توليد مناظر طبيعية متميزة للتطور المستمر ثلاثي الأبعاد للبروتينات المنقاة الشائعة ، وهو فعال في تمييزها بناء على التعرف على الأنماط. تتمتع هذه التقنية بالعديد من المزايا مقارنة بالطرق الحالية مثل العرفان الكلاسيكي والإلكتروني والألسنة. أولا ، يتم تبسيط إعداد مستقبلات الغناء إلى حد كبير.
يمكن اختيار مجموعة كبيرة ومتنوعة من المستقبلات التفاعلية المتقاطعة عن طريق خلط عدد صغير من الجزيئات. ثانيا ، بفضل النهج الاندماجي ، يمكن اعتبار أنماط التعرف الناتجة عن لساننا الإلكتروني مستمرة ، بحيث يمكن التعرف على الإشارات غير الطبيعية بسهولة أكبر. لذلك ، يمكن الحصول على تحليل أكثر موثوقية لإعداد مجموعة المستقبلات التوافقية التفاعلية.
أولا ، قم بتنظيف السطح الذهبي للمنشور قبل 48 ساعة من الاستخدام باستخدام منظف البلازما لمدة ثلاث دقائق تحت 75٪ أكسجين ، و 25٪ أرجون ، و 0.6 ملي بار ، و 40 واط من الطاقة. ثم قم بإعداد 100 مل من محلول عازلة الفوسفات الذي يحتوي على 10٪ جلسرين أو PBSG. تعد إضافة الجلسرين إلى PBS أمرا مهما جدا لتقليل تبخر المذيبات والتغيرات في لبنة البناء أو تركيز BBB بعد الترسيب.
ثم قم بإعداد محاليل مخزون اللاكتوز أو لبنة البناء الأولى واللاكتوز الكبريتات ، أو لبنة البناء الثانية من محاليل المخزون. قم بإعداد 11 محلولا نقيا ومختلطا بنسب تتراوح بين صفر و 100٪ بزيادات قدرها 10٪ وتركيز إجمالي لبنة بناء يبلغ 0.1 ملليمولار في PBSG ، قم بإيداع ثمانية قطرات نانولتر من هذه المحاليل النقية والمختلطة على سطح المنشور باستخدام نصاب غير ملامس في مكررة رباعية لكل نسبة مع 44 نقطة في المجموع ضع المنشور داخل طبق بتري يحتوي على مليلتر واحد من الماء النقي للغاية واتركه طوال الليل عند درجة حرارة الغرفة للتجميع الذاتي ل BB واحد و BB اثنين على السطح الذهبي هنا. من المفترض أن متوسط تكوين السطح في الطبقات الأحادية المختلطة ذاتية التجميع يعكس تكوين المحلول المختلط للترسيب.
في اليوم التالي ، اغسل المنشور جيدا بالماء عالي النقاء قبل تجفيفه تحت تدفق الأرجون. اضبط الحاضنة التي توضع فيها أجهزة تصوير البلازما والرنين السطحية عند 25 درجة مئوية لتجنب تغيرات معامل الانكسار الناجمة عن تغير درجة الحرارة أثناء استشعار البروتين. أدخل منشور شطف غير وظيفي في خلية تدفق كيتون البولي إيثر سعة 10 ميكرولتر متصلة بمضخة حقنة يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر ، وجهاز إزالة وصمام حقن متوسط الضغط بستة منافذ.
املأ نظام التدفق بمخزن مؤقت يعمل حديثا وأكوام ديغا. قم بإزالة منشور الشطف وأدخل المنشور الذي يحتوي على مصفوفة المستقبلات التفاعلية المتقاطعة المركبة في أكوام تشغيل خلية التدفق بمعدل تدفق 100 ميكرولتر في الدقيقة. بمساعدة كاميرا CCD ، قم بإزالة أي فقاعات هواء موجودة على سطح المنشور عن طريق تمرير المخزن المؤقت للتشغيل.
حدد منطقة الدراسة بسرعة لكل بقعة عن طريق رسم دائرة بنفس القطر لمنطقة الاهتمام بناء على صورة متباينة جيدا للمصفوفة ، وبمساعدة برنامج متكامل في نظام تصوير البلازما والرنين السطحي ، تتبع منحنيات البلازما ، والتي تمثل منحنيات الانعكاسية كدالة لزاوية السقوط لجميع البقع. اختر زاوية العمل ، وهي الموضع الذي سيتم فيه تسجيل المنحنيات الحركية عند أعلى منحدر لمنحنيات الانعكاسية. قم بتدوير مرآة المسح الضوئي لإصلاح زاوية العمل المحددة للقياسات الحركية.
استمر في تشغيل الأكوام عبر نظام التدفق حتى تصبح إشارة الانعكاسية لجميع البقع مستقرة وثابتة. ثم استخدم حقنة لحقن مليلتر واحد من ليكتين الفول السوداني أو محلول HL في حلقة عينة 500 ميكرولتر مع صمام الحقن في موضع التحميل مع ضبط معدل التدفق على 100 ميكرولتر في الدقيقة ، ضع صمام الحقن في وضع الحقن. ابدأ القياسات الحركية من خلال مراقبة اختلافات الانعكاسية مع الوقت في وقت واحد على جميع البقع في نهاية حقن البروتين.
اشطف المصفوفة باستخدام المخزن المؤقت للتشغيل لمدة ثماني دقائق. أخيرا ، قم بحقن مليلتر واحد من 1٪ DS لإعادة إنشاء المصفوفة. كرر نفس الإجراء للبروتينات الأخرى بعد دخول محلول البروتين في خلية التدفق.
يحدث الارتباط الجزيئي ويؤدي إلى تحول في منحنيات البلازما واختلاف في الانعكاسية. يقوم برنامج الحصول على الصور بتحويل قيم شدة الضوء المقاسة إلى مستويات مقياس رمادي ، مما يعطي صور SPR ويولد تباينا في الانعكاسية مقابل الوقت الذي يعطي جرامات المستشعر. بعد ذلك ، استخدم برنامج حوسبة رياضية لرسم الانعكاسية في نهاية كل حقن بروتين مقابل نسبة اللبنة الأساسية لإنشاء ملف تعريف تطور مستمر ثنائي الأبعاد لكل عينة.
أخيرا ، أضف نسبة اللبنة الأساسية إلى جرامات المستشعر لإنشاء نمط التعرف المستمر المعتمد على الوقت يسمى مشهد التطور المستمر ثلاثي الأبعاد لكل بروتين لاستكشاف قدرة اللسان الإلكتروني لتحليل البروتين الشائع ، تم استخدام ثلاثة بروتينات HL myoglobin و lysozyme لكل بروتين. تم إنشاء ملف تعريف تطور مستمر ثنائي الأبعاد متميز بواسطة اللسان الإلكتروني كما هو موضح في 3D. كما تم إنشاء مناظر طبيعية للتطور المستمر لميوغلوبين HL والليزوزيم.
اللسان الإلكتروني حساس للخصائص السطحية للبروتينات ، مثل توزيع بقايا الأحماض الأمينية الكارهة للماء والمحايدة والمشحونة. يمكن استخدام ملفات تعريف التطور المستمر التي تم الحصول عليها للمناظر الطبيعية كبصمات للتمييز الفعال للبروتين والتحديد المستقبلي بناء على التعرف على الأنماط. أثناء محاولة هذا النهج ، من المهم أن تتذكر اتباع الإجراءات التجريبية المحسنة والموحدة من أجل ضمان قابلية التكرار الجيدة للسان الإلكتروني.
تشمل هذه الإجراءات سطحا نظيفا وجيدا للمنشور ، واختيار زاوية العمل لتصوير رنين البلازما السطحي ، وتطبيق الحل المناسب لإعادة تجديد النظام بالكامل لإعادة الاستخدام. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية بناء اللسان الإلكتروني بناء على نهج COMBINATOR والتصوير بالرنين بالبلازما SOFA لتحليل البروتين. حظا سعيدا لتجاربك.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة جديدة لبناء اللسان الإلكتروني (eT) تعمل على تبسيط تصميم وإنتاج مواد الاستشعار. اللسان الإلكتروني قادر على توليد ملفات تعريف ومساحات تطور مستمرة للعينات السائلة، مما يدل على كفاءة في تحليل البروتينات وتمييزها.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- التكنولوجيا الحيوية
- الكيمياء التحليلية
الخلفية
- اللسان الإلكتروني هو جهاز يقلد الإدراك الذوقي البشري.
- يُستخدم لتحليل العينات السائلة المعقدة.
- الطرق الحالية لبناء اللسان الإلكتروني يمكن أن تكون معقدة وتستغرق وقتًا طويلاً.
- تهدف هذه الدراسة إلى تحسين كفاءة تصميم وإنتاج اللسان الإلكتروني.
هدف الدراسة
- بناء لسان إلكتروني باستخدام نهج تكاملي.
- إجراء تصوير البلازما السطحية والرنيني لتحليل البروتينات.
- إنشاء مساحات تطور مستمرة ثلاثية الأبعاد مميزة للبروتينات المنقاة.
الطرق المستخدمة
- استخدام اللاكتوز واللاكتوز الكبريتات كوحدات بنائية.
- التجميع الذاتي لمصفوفات المستقبلات على سطح الذهب.
- تطبيق تصوير البلازما السطحية والرنيني لرصد أحداث الارتباط.
- معالجة البيانات لتوليد ملفات تعريف تطور مستمرة ثنائية وثلاثية الأبعاد.
النتائج الرئيسية
- اللسان الإلكتروني ينجح في إنشاء مساحات ثلاثية الأبعاد مميزة لتحليل البروتينات.
- يُظهر كفاءة في التمييز بين البروتينات المنقاة الشائعة.
- تبسط الطريقة تحضير المستقبلات الفردية.
- يتم تحقيق الرصد في الوقت الحقيقي لأحداث الارتباط من خلال تصوير SPR.
الاستنتاجات
- تقدم طريقة بناء اللسان الإلكتروني الجديدة مزايا كبيرة على التقنيات التقليدية.
- تعزز كفاءة تحليل البروتينات وتمييزها.
- يمكن أن يؤدي هذا النهج إلى تطبيقات أوسع في الاستشعار البيوكيميائي.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
The electronic tongue (eT) platform described enables rapid generation of cross-reactive receptor arrays for protein discrimination, addressing a key bottleneck in early-stage biomarker and target validation workflows. By producing continuous recognition patterns (2D CEP and 3D CEL) via SPRi, the method supports mechanistic de-risking through label-free, real-time binding kinetics. This approach enhances predictive confidence in protein target engagement assays, particularly for complex mixtures where traditional single-target sensors may fail.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through pattern-based discrimination of purified proteins, reducing reliance on single-target assumptions.
- Operational Value: Simplifies receptor array preparation using only two building blocks (lactose and sulfated lactose) to generate diverse cross-reactive sensors.
- Predictive Value: Generates continuous evolution landscapes that serve as protein-specific fingerprints, improving target selectivity assessment in discovery screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Creates standardized, reproducible sensor arrays via controlled self-assembly of building block mixtures on gold surfaces.
- Quantitative Output: Produces sensor grams and continuous evolution profiles that quantify binding responses across varying building block ratios.
- Scalability: Supports high-density spotting (44 spots in quad duplicate) for parallel protein analysis, enabling assay miniaturization and reuse.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: The eT’s sensitivity to surface amino acid distributions (hydrophobic, neutral, charged) allows alignment with disease-relevant protein variants.
- Mechanistic De-risking: Continuous recognition patterns help distinguish specific from non-specific binding, reducing false positives in preclinical target validation.
- Biomarker Alignment: Distinct 3D CELs for proteins like myoglobin and lysozyme demonstrate potential for fingerprinting biomarker candidates in complex fluids.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by providing orthogonal protein characterization data after initial hit identification but before lead optimization, particularly for targets requiring conformational or surface property analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by generating differential recognition patterns for proteins with similar sequences but different surface properties.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible surfaces with quantitative kinetic outputs (sensor grams) for comparing protein interactions.
- Analytics: Enables data-driven comparison via 2D CEP (end-point binding vs. ratio) and 3D CEL (time-resolved binding landscapes) for pattern-based classification.
- Translational Research: Connects to preclinical work by offering a reusable platform for monitoring protein variants or post-translationally modified forms.
- Enterprise Reuse: The combinatorial approach allows regeneration (via 1% DS injection) and reuse of the same array across multiple protein targets, reducing reagent costs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in protein interaction studies through continuous, label-free monitoring of binding events.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized surface preparation (plasma cleaning, overnight self-assembly) and defined working angle selection for SPRi.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing multi-parametric recognition patterns that capture complex binding behaviors missed by endpoint assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of protein targets based on unique fingerprints, decreasing late-stage failure due to unanticipated binding profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface plasmon resonance imaging and microfluidic flow cell setup.
- Depends on non-contact spotter precision for nanoliter droplet deposition and plasma cleaning equipment for surface preparation.
- Necessitates cross-team standardization of building block ratios, PBSG buffer conditions, and regeneration protocols (1% DS) for reproducible results.
- Adaptation to other model systems may require re-optimization of building block choices and self-assembly conditions based on surface chemistry.
- Practical limitations include sensitivity to solvent evaporation (mitigated by 10% glycerol in PBSG) and the need for air bubble removal during flow cell setup.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:57
Preparation of the Combinatorial Cross-reactive Receptor (CoCRR) Array
3:45
Protein Sensing by Surface Plasmon Resonance Imaging (SPRi)
6:05
Data Processing and Analysis
6:54
Results: Continuous Evolution Profiles and Landscapes for Protein Analysis
7:47
Conclusion
