الاستفادة من تصميم مخصص انجذاب غلفاني غرف لدراسة الاتجاه الهجرة من خلايا البروستاتا

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء Galvan Axxis ، وهو اختبار لتقييم الهجرة الاتجاهية للخلايا في مجال كهربائي مطبق. يتم تحقيق ذلك عن طريق تجميع غرفة Galvan axxis أولا ثم بذرها بالخلايا ذات الأهمية. في الخطوة الثانية ، يتم إغلاق الغرفة ويتم تطبيق مجال كهربائي للتصوير بفاصل زمني.

في الخطوة الأخيرة ، يتم تتبع سرعة هجرة الخلايا الفردية والزاوية بالنسبة للمجال الكهربائي. في النهاية cosign. يمكن استخدامه لإظهار كيفية استجابة الخلايا للمجال الكهربائي وما إذا كانت تهاجر اتجاهيا إلى الكاثود.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي سهولة استرجاع الخلايا بعد إعطاء تكساس للتحليل الثانوي والسهولة التي يمكن بها تصوير الهجرة بتكبير عال وباستخدام الخلايا المصنفة بالفلورسنت. يعد تصور هذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات تجميع الغرفة دون عرض توضيحي لتجميع الغرف السفلية. ابدأ بمسح غرفة محور الجلفان البلاستيكية باثنين من البروبانول.

ثم استخدم حقنة لتطبيق مانع تسرب السيليكون من الدرجة البحرية حول الفتحات الدائرية على الجانب السفلي من الغرفة. رتب غطاء زجاج كبير فوق المادة المانعة للتسرب واضغط عليه في مكانه بنهاية قضيب القطن ، وامسح الغراء الزائد بقطعة قطن. ثم استخدم علامة نقطة ماسية لقطع غطاء زجاجي صغير لعمل مسافات ستة × 25 ملم وقلبها فوق الغرفة.

بعد ذلك ، استخدم حقنة لتطبيق خطين من السيليكون ، مما يؤدي إلى إنشاء سطح قناة 10 × 25 ملم لربط الخلية بين الفتحتين الدائريتين على الزجاج السفلي. ثم قم بلصق مساحتين زجاجيتين بين الفتحات الدائرية ، وادفع الفراغات لأسفل باستخدام قضيب قطني جديد وامسح الغراء الزائد كما هو موضح للتو. جرب الغرفة لمدة 24 ساعة حتى يتم علاج غراء السيليكون.

في اليوم التالي ، انقع الغرفة في الماء المقطر طوال الليل لإزالة بقايا حمض الخليك من الغراء قبل زرع الخلايا في الغرفة. جفف وامسح الغرف باثنين من البروبانول كما هو موضح للتو. اغسلها ب PB S3 المعقم مرات ثم تحقق من تدفق السائل بين الفتحتين الدائريتين في الغرف.

بعد التأكد من أن الغرف في حالة عمل جيدة ، قم بإحاطتها بأطباق ثقافة معقمة وضع الغرف عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. أثناء توازن الغرف ، افصل خلايا البروستاتا عن طبق استزراعها بخمسة ملليلتر من التربسين EDTA عند 37 درجة مئوية. بعد خمس دقائق ، قم بتحييد التفاعل بخمسة ملليلتر من 10٪ FBS.

في PBS ، انقل الخلايا المنفصلة إلى أنابيب سعة 15 مليلتر ثم جهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق. في 200 مرة ، G ، استنشق الوسط ثم أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من المتوسط. ثم بعد عد الخلايا ، اضبط تركيز الخلية إلى ثمانية × 10 إلى الخلايا الأربع لكل مليلتر مع وسط الاستزراع والبذور.

350 ميكرولتر من تعليق الخلية على كل غرفة. احتضان الخلايا في الغرفة طوال الليل في طبق استزراع بمنديل كيم مبلل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، ابدأ في تجميع الغرف العلوية عن طريق تسخين 10 ملليلتر من الثقافة أولا ، متوسطة إلى 37 درجة مئوية لكل غرفة جلفان AXS.

أثناء ارتفاع درجة حرارة الوسائط ، انقل غرفة Galvan axxis من الحاضنة إلى لوحة تسخين 37 درجة مئوية واشطف الغرفة بوسط الاستزراع. لإزالة الخلايا غير المتصلة ، اترك 400 ميكرولتر من الوسط في الغرفة ثم استخدم حقنة لتطبيق شحم عالي التفريغ فوق كل من المساحات الزجاجية. أغلق الغرفة بغطاء زجاجي وقضيب قطني ، ثم جفف السطح الزجاجي.

بعد ذلك ، ضع الشحوم ذات الفراغ العالي باستخدام حقنة لسد الفجوة بين زجاج الغطاء والغرفة. ثم أضف وسط الثقافة إلى الخزانات الداخلية. قم بإزالة الفقاعات وتحقق من تدفق السائل بين الخزانات.

لجعل جسور الأجار تقطع زوجا من أنابيب PVC بوصتين ، اقلبها ثم ضع القطع في دورق سعة 100 مل. بعد ذلك ، أضف 200 ملليغرام من أجار إصبع القدم في قارورة سعة 50 مليلتر مع 10 ملليلتر من وسط الثقافة لصنع هلام أجار بنسبة 2٪. بعد الطهي في الميكروويف لمدة 30 ثانية ، استخدم ماصة نقل لتحميل هلام الأجار في الأنبوب البلاستيكي واترك جسور الأجار في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لتصلب الأجار.

ثم أضف ملليلترين من وسط الاستزراع إلى الخزانات الخارجية لغرفة الجال ، وأدخل جسور الأجار في الخزانات المتوسطة الداخلية والخارجية لإجراء التيار لإجراء تصوير بفاصل زمني للهجرة. ابدأ بنقل غرفة Galvan إلى غرفة بيئية 37 درجة مئوية على مرحلة المجهر ، وتأمين الغرفة بشريط والتركيز على الخلايا تحت هدف 10 ×. بعد ذلك ، أدخل أقطاب Galvan Axxis في الخزانات الخارجية مع وجود الكاثود على الجانب الأيمن ، وتأمين السلك والأقطاب الكهربائية بالشريط.

ثم قم بتشغيل صندوق الطاقة لتطبيق مجال كهربائي على الغرفة ، واستخدم مقياس الجهد لقياس جهد الخرج عبر الغرفة ليصل إلى 2.5 فولت للغرفة التي يبلغ طولها 25 ملم. حدد الآن 10 نقاط عبر الغرفة لإنشاء 10 أفلام بفاصل زمني ، واضبط شروط الاستحواذ على فواصل زمنية مدتها 10 دقائق لمدة ساعتين. ثم ابدأ التصوير واضبط تيار الإخراج حسب الحاجة للحفاظ على شدة المجال أثناء التجربة.

في نهاية التجربة ، قم بإزالة الغرفة من المسرح وقم بإصلاح الخلايا في 95٪ من الكحول. ثم افتح الغرفة. يمكن حفظ زلة الغطاء لوقت لاحق.

تلطيخ وتصوير. تنظيف الغرفة للسنوات القادمة. لتحديد كمية Galvan Axxis ، قم بتدوير أفلام اللقطات المتتابعة لتوجيه الكاثود إلى أعلى الصور.

قم بتصدير الأفلام إلى برنامج تتبع الخلايا وتتبع موضع XY يدويا من 10 إلى 20 خلية في كل نقطة زمنية من كل فيلم ، ومسافات الهجرة والزوايا المتعلقة باتجاه الشمال الجنوبي ، وسيتم حساب نفس اتجاه المجال الكهربائي في برنامج تتبع الخلية. أخيرا ، احفظ القياسات واستورد البيانات إلى تطبيق قاعدة بيانات لحساب النتائج المجمعة. في هذه التجربة التمثيلية Galvan Axxis ، تم تحديد خطوط خلايا البروستاتا للهجرة بسرعات مماثلة على مدار ساعتين.

ومع ذلك ، كان الاتجاه إلى المجال الكهربائي 0.7 زائد ناقص 0.3 ل PRNS سطر واحد ، و 0.2 زائد ناقص 0.8 لخطين PNT ، مما يشير إلى اختلاف كبير في محور Galvan لهذين الخطين الخليين ، مما يشير إلى آليات الإشارات الخلوية الخاصة بهم استجابات الهجرة التفاضلية المباشرة إلى المجال الكهربائي بعد تطوير طريقة Govan Texas. تساعد هذه التقنية الباحثين على استكشاف آليات هجرة الخلايا الاتجاهية في المجال الكهربائي.