تحليل العصبية كريست الهجرة جذع الخلية باستخدام التعديل الفحص غرفة زيجموند

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم قدرة جزيء معين على تحفيز الانجذاب الكيميائي واستجابات هجرية أخرى في خلايا العرف العصبي المستأصلة من الجذع. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل الأنابيب العصبية على مستوى الجذع، والتي يتراوح طولها تقريباً بين 8 و15 قطعة عضلية (somites)، وزراعة كل من هذه الأنابيب العصبية طوال الليل على شرائح غطاء منفصلة مطلية بالفبرونيكتين للسماح بهجرة العرف العصبي. بعد ذلك، يتم اختيار المزرعة المثلى للعرف العصبي.

يتم إخراج الأنبوب العصبي من المزرعة، ثم تُثبّت الشريحة الغطائية التي تحتوي على المزرعة في غرفة زيغموند (zigmund chamber) مُعدلة، بحيث تكون الحافة الأكثر استقامة للمزرعة موازية لمتجه التدرج الجزيئي الذي سيتم تطبيقه عبر المزرعة. تتمثل الخطوة الثالثة في إنشاء تدرج جزيئي عبر المزرعة، ومن ثم تصوير هجرة خلايا العرف العصبي المحيطية على طول الحافة المستقيمة المختارة سابقاً للمزرعة. وتتمثل الخطوة النهائية في تتبع وتحليل هجرة خلايا العرف العصبي المحيطية المتمركزة على طول الحافة المختارة للمزرعة باستخدام برنامج Image J.

وفي النهاية، يمكن تحديد ما إذا كان الجزيء المختار قادرًا على تغيير اتجاهية الخلية أو خصائص هجرية أخرى مثل السرعة من خلال تحليل بيانات مسار الخلية التي تم الحصول عليها. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالتقنيات الحالية، مثل مقايسة غرفة بويدن (Boyden chamber assay)، في تكلفتها المنخفضة جدًا. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحليل هجرة الخلايا المستقطبة بالفعل على محيط مزارع القطاعات الأولية (primary explan cultures) باستخدام التصوير بفاصل زمني.

بعد تحضين بيض الدجاج لمدة 56 ساعة عند 38 درجة مئوية، أخرج البيض من المحضنة، ورشه برفق بـ 70%ethanol، ثم اترك البيض ليجف. املأ طبق بتري بلاستيكي معقم بمحلول رينجر الخاص بالدجاج وقم بتعقيم صينية زجاجية باستخدام الأشعة فوق البنفسجية. املأ طبق بتري زجاجي بقطر خمسة سنتيمتر بمحاليل العرض.

الآن، قم بكسر البيض في صينية زجاجية معقمة بالأشعة فوق البنفسجية (UV). استخرج كل جنين من محّ البيضة عن طريق القص أولاً حول الجزر الدموية للجنين باستخدام مقص منحني. بعد ذلك، وباستخدام ملقط غير مدبب، ارفع الجنين من غشائه خارج الجنيني وضعه في طبق بيتري المجهز والذي يحتوي على محلول ringers.

بعد ذلك، اختر حوالي تسعة أجنة في مراحل ما بين "هامبرغر" و"هاميلتون". في المراحل من 15 إلى 17، استخدم إبرة تنجستن لقطع أي أنسجة جنينية تقع أمام الميوتوم (somite) رقم 10، وقم بإزالة جميع الأنسجة الجنينية الذيلية بدءاً من حوالي خامس ميوتوم تم تشكيله حديثاً. ثم قم بتقليم الأغشية خارج الجنينية لتصل إلى حوالي 2 mm من الجنين.

ضع جذوع الأجنة المعزولة في أحواض ديز واتركها في الحضانة لمدة ساعة و15 دقيقة عند 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون. وأثناء فترة حضانة جذوع الأجنة، قم بتجهيز ست شرائح غطاء للزراعة، وذلك أولاً عن طريق شطفها بـ 70% ethanol وتركها لتجف.

بعد ذلك، وباستخدام قلم تحديد للمختبر، ارسم دائرة في مركز كل شريحة غطاء يبلغ قطرها حوالي 1 سنتيمتر، وذلك لتمييز غطاء الفيبرين الرابط لاحقاً على الوجه نفسه من كل شريحة غطاء. اكتب كلمة أو رمزاً غير متماثل خارج الدائرة المرسومة لتسهيل تحديد الجزء العلوي والسفلي من شريحة الغطاء. الآن، ضع كل شريحة غطاء في طبق معقم منفصل بمقاس 40 في 10 مليمتر بحيث يكون الجانب المسمى متجهاً للأسفل، واترك الطبق مفتوحاً تحت مصباح UV مبيد للجراثيم لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، ضع 60 µL من الفيبرونيكتين على السطح غير المعلم من غطاء الشريحة داخل الدائرة التي يبلغ قطرها 1 cm، مع التأكد من تغطية كامل مساحة الدائرة. ضع الأطباق في الحاضنة عند 37 °C لمدة 30 دقيقة. وبعد انتهاء فترة التحضين، قم بشفط الفيبرونيكتين بعناية من كل غطاء شريحة.

بعد ذلك، أضف 250 µL من وسط الزرع إلى المنطقة المطلية بـ FI nin. غطِّ الشريحة الغطائية، ثم قم بتحضين الشرائح الغطائية مرة أخرى حتى يتم عزل الأنابيب العصبية. وأثناء تحضين الشرائح الغطائية، املأ طبق بتري زجاجي بقطر 5 cm بوسط L 15.

انقل الآن جميع جذوع الأجنة التي تم تحضينها إلى طبق بتري المجهز. استخدم ملقطاً دقيقاً وملقطاً حاداً وإبرة لتشريح الأنبوب العصبي عن طريق القطع بعناية على طول الحدود الفاصلة بين الأنبوب العصبي والجسيدات باستخدام الإبرة. قم بإزالة شرائح التغطية من الحاضنة.

اختر ستة من أطول الأنابيب العصبية وأكثرها استقامة، ثم وباستخدام رأس ماصة دقيقة مجهز بوسط استزراع، انقل أنبوباً عصبياً واحداً إلى كل شريحة غطاء من الشرائح الست. تأكد من وضع كل أنبوب عصبي ضمن المنطقة المطلية بالفبرونكتين في شريحة الغطاء الخاصة به باستخدام الماصة الدقيقة، ثم قم بالتحضين طوال الليل عند 37 °C و5% carbon dioxide. بعد ذلك، ضع 2 mL على الأقل من وسط الاستزراع الخالي من المصل في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 mL.

اترك الغطاء غير محكم الإغلاق قليلاً أثناء تحضين الأنبوب طوال الليل عند 37 درجة Celsius و5% carbon dioxide للسماح بتعديل pH الوسط. بعد الزرع طوال الليل، اختر أفضل ثلاث مزارع لخلايا العرف العصبي والتي تمتلك حافة مستقيمة واحدة طويلة على الأقل من بين المزارع الثلاث. اختر واحدة لتحميلها في الحجرة الأولى وأعد المزارع الأخرى إلى الحاضنة لاستخدامها لاحقاً.

بعد ذلك، وباستخدام مسحة قطنية، ضع طبقة رقيقة ومتساوية من الفازلين على المناطق المحيطة بالخزانات وجسر إحدى غرف سيغموند المعدلة. تالياً، وباستخدام إبرة تنجستن، قم بإزالة الأنبوب العصبي برفق من شريحة التغطية التي تحتوي على مزرعة خلايا العرف العصبي المختارة، مع ترك خلايا العرف العصبي المحيطة ملتصقة بطبقة الفبرونيكتين. ضع علامة على الطبق باستخدام قلم تحديد مختبري لتذكر اتجاه الحافة الأكثر استقامة لمزرعة خلايا العرف العصبي.

بعد ذلك، ضع بضع قطرات من الوسط الذي سبق تحضينه على جسر غرفة زيغموند المعدلة. ثم التقط غطاء الشريحة باستخدام ملقط دقيق. امسح حافة غطاء الشريحة بمنديل كيم لإزالة معظم وسط المزرعة القديم، ثم ضع غطاء الشريحة فوراً على غرفة زيغموند المعدلة بحيث تكون الحدود المستقيمة لخلايا العرف العصبي المراد تصويرها متمركزة فوق طول الجسر وعمودية تقريباً على حدود خزان الجسر.

باستخدام مجهر مقلوب، حرك حدود خلايا العرف العصبي المستقيمة إلى جانب الجسر الأقرب إلى الخزان. سيؤدي ذلك إلى احتواء المادة الجاذبة الكيميائية المشتبه بها ومحاذاة حدود خلايا العرف العصبي المستقيمة بشكل أدق لتكون عمودية على حدود خزان الجسر. الآن، اضغط بغطاء الانزلاق بعناية وإحكام فوق هلام البترول الموجود على غرفة زيغموند، مع التأكد من إغلاقها تماماً على الغرفة.

ثم ضع كمية إضافية من الهلام البترولي على طول حافة غطاء الشريحة لضمان إحكام غلقها ومنع تسرب الهواء. اضبط زاوية حدود خلايا العرف العصبي مرة أخرى لتصحيح أي حركة حدثت أثناء عملية التثبيت. بعد ذلك، اسحب حوالي 300 µL من الوسط الذي سبق تحضينه في سرنجة سعة 1 mL.

باستخدام إبرة متصلة مقاس 25 وبعرض 1.5 بوصة، احقن الوسط في الخزان الذي لن يحتوي على أي مواد جاذبة كيميائياً حتى يمتلئ، مع الحرص على عدم تكوين أي فقاعات داخل الخزان.

ثم قم بسد الخزان من كلا الجانبين بكمية كافية من الفازلين قبل تعبئة الخزان التالي. الآن، قم بتعبئة محقنة ثانية بـ 300 µL من الوسط الذي تم تحضينه مسبقاً ويحتوي على المادة الجاذبة الكيميائية المطلوبة. ثم احقن الوسط في الخزان المقابل بنفس الطريقة.

مرة أخرى، يتم إغلاق الخزان بعناية باستخدام الفازلين. بعد ذلك، يتم تحضين غرفة Sigmund المحملة عند 37 degrees Celsius لمدة ساعة واحدة قبل التصوير. ثم أثناء التحضين عند حوالي 37 degrees Celsius، يتم تصوير الحافة الأكثر استقامة من مزرعة خلايا العرف العصبي لمدة ثلاث ساعات على فترات زمنية قدرها 92 ثانية للمجموعات الضابطة، مع تحميل غرف zigmund التي تحتوي على كل من مزرعتي خلايا العرف العصبي الأخريين الأفضل كما تم توضيحه للتو.

استخدام معالجات الضبط المناسبة لملء الخزانات وتحضير الجسر. استخدم إضافة التتبع اليدوي في برنامج Image J لتتبع هجرة خلايا العرف العصبي المحيطية على طول الحدود المستقيمة للمزرعة. استخدم إضافة أداة الانجذاب الكيميائي والهجرة لتحليل المعايير المختلفة لمسارات الهجرة التي تم الحصول عليها.

تم تحضير مستنبتات خلايا العرف العصبي من الجذع المستطيل عن طريق استنبات الأنابيب العصبية طوال الليل، ثم تم اختيار مستنبتات خلايا العرف العصبي الناتجة التي تحتوي على حدود مستقيمة طويلة واحدة على الأقل لإجراء التجارب. بعد ذلك، تم وضع أطول حدود مستقيمة للمستنبت المختار بشكل عمودي على حدود خزان الجسر، وبالتالي بشكل موازٍ لمتجه التدرج الذي سيتم تطبيقه لاحقاً. تم ملء الخزان الذي لا يحتوي على المادة الجاذبة الكيميائية المشتبه بها، والمشار إليه هنا بعلامة ناقص، أولاً ثم تم إغلاقه بإحكام.

بعد ذلك، تم ملء الخزان الآخر بالمادة الجاذبة الكيميائية المشتبه بها والمشار إليها بعلامة زائد، ثم تم تصوير وتتبع خلايا العرف العصبي الطرفية المختومة على طول الحدود المختارة مسبقاً باستخدام ملحق التتبع اليدوي لبرنامج image J. ويمكن تقييم العديد من خصائص الهجرة استجابةً للتدرج المطبق بناءً على بيانات التتبع التي تم الحصول عليها كما هو موضح في هذا الرسم البياني. على سبيل المثال، يمكن اشتقاق مؤشر الانجذاب الكيميائي عن طريق قسمة إزاحة الخلية على طول المحور x على إجمالي المسافة التي هاجرتها. ويظهر مخطط مسار الخلايا المعروض هنا الاستجابة الجاذبة لجميع الخلايا التي تم تتبعها.

يمثل كل مسار أحمر مسار خلية هاجرت نحو الخزان المحمل بمادة يُشتبه في أنها جاذبة كيميائياً. في هذا الشكل، يوجد عدد أكبر بكثير من المسارات الحمراء مقارنة بالمسارات السوداء. وفي اختبار آخر، تم التحقق من قدرة غرفة سيغموند المعدلة على الحفاظ على تدرج جزيئي.

تمت إضافة مترافق Alexa Fluor 488 IGM إلى الخزان الأيسر، وقيست شدة الفلورة عبر الجسر في أوقات مختلفة. وقد استمر التدرج لمدة 26 ساعة على الأقل. بعد مشاهدة الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل قدرة الجزيء على تحفيز الانجذاب الكيميائي وسلوكيات الهجرة الأخرى في مزارع خلايا العرف العصبي للجذع المستأصلة باستخدام مقايسة غرفة زيغموند المعدلة.