تحليل العصبية كريست الهجرة جذع الخلية باستخدام التعديل الفحص غرفة زيجموند
January 19th, 2012
يوصف هذا النهج لتحليل الهجرة من الخلايا explanted (خلايا الجذع قمة العصبية). هذه الطريقة غير مكلفة، لطيف، وقادرة على التمييز الكيميائي من كلا تنشيط كيميائي والتأثيرات الأخرى على الاستقطاب المهاجرة مثل تلك المشتقة من خلية خلية التفاعلات داخل الجذع العصبية الأولية قمة الثقافة الخلية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم قدرة الجزيء على استنباط الانجذاب الكيميائي والاستجابات المهاجرة الأخرى في خلايا القمة العصبية للجذع المزروعة. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الأنابيب العصبية على مستوى الجذع أولا بين ما يقرب من ثمانية و 15 جسيمة في الطول وزراعة كل أنبوب من الأنابيب العصبية بين عشية وضحاها على زلات غطاء منفصلة مطلية بالفيبرونيكتين للسماح بهجرة القمة العصبية. بعد ذلك ، يتم اختيار ثقافة القمة العصبية المثلى.
تتم إزالة الأنبوب العصبي من المزرعة ويتم تثبيت زلة الغطاء التي تحتوي على المزرعة على غرفة متعرجة معدلة بحيث يكون الحد الأكثر استقامة للثقافة موازيا لمتجه التدرج الجزيئي المراد تطبيقه عبر الثقافة. تتمثل الخطوة الثالثة في إنشاء تدرج جزيئي عبر الثقافة ثم تصوير هجرة خلايا القمة العصبية الطرفية على طول الحدود المستقيمة المحددة مسبقا للثقافة. تتمثل الخطوة الأخيرة في تتبع وتحليل هجرة خلايا القمة العصبية الطرفية الموضوعة على طول الحدود المحددة للثقافة باستخدام برنامج Image J.
في النهاية ، يمكن تحديد ما إذا كان الجزيء المحدد يمكنه تغيير اتجاه الخلية أو خصائص الهجرة الأخرى مثل السرعة من خلال تحليل بيانات مسار الخلية التي تم الحصول عليها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على التقنيات الحالية مثل اختبار غرفة Boyden ، هي أنها بتكلفة منخفضة للغاية. يمكن استخدام هذه الطريقة لتحليل هجرة الخلايا المستقطبة بالفعل على محيط الثقافات الأولية باستخدام التصوير بفاصل زمني.
بعد احتضان بيض الكتاكيت لمدة 56 ساعة عند 38 درجة مئوية ، أخرج البيض من الحاضنة ، ورشه برفق بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم اترك البيض يجف أثناء تجفيف البيض. املأ طبق بتري بلاستيكي معقم بمحلول رنين الفرخ وقم بتعقيم صينية زجاجية بالأشعة فوق البنفسجية. املأ طبق بتري زجاجي يبلغ طوله خمسة سنتيمترات بشاشات عرض.
الآن اكسر البيض في صينية زجاجية معقمة بالأشعة فوق البنفسجية. استخرج كل جنين من صفار البيض عن طريق قطع جزر دم الجنين أولا بمقص منحني. ثم باستخدام ملقط حاد ، التقط الجنين من غشاءه الجنيني الإضافي وضع الجنين في طبق بتري المحضر الذي يحتوي على الرنين.
بعد ذلك ، حدد حوالي تسعة أجنة تقع بين الهامبرغر وهاميلتون. المراحل من 15 إلى 17 بإبرة التنغستن تقطع أي أنسجة جنينية أمامية إلى سوس 10 وإزالة جميع الأنسجة الجنينية الحبالية بدءا من حوالي الخامس الأكثر تكوينا حديثا حتى العث. ثم قم بقص الأغشية الجنينية الإضافية إلى حوالي ملليمترين من الجنين.
ضع جذوع الأجنة المعزولة في خلجان الأجينة واحتضانها لمدة ساعة و 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون أثناء احتضان جذوع الجنين. قم بإعداد ست زلات غطاء للزراعة. أولا عن طريق شطفها بنسبة 70٪ من الإيثانول والسماح لها بالجفاف.
ثم باستخدام علامة مختبر ، ارسم دائرة في وسط كل زلة غطاء يبلغ قطرها حوالي سنتيمتر واحد للتعرف لاحقا على طبقة توصيل الفيبرين على نفس وجه كل زلة غطاء. اكتب كلمة أو رمزا غير متماثل خارج الدائرة المرسومة لتسهيل التعرف على الجزء العلوي والسفلي من قسيمة الغلاف. الآن ضع كل زلة غطاء في طبق معقم منفصل مقاس 40 × 10 ملم بحيث يكون الجانب الملصق متجها لأسفل ، واترك الطبق مفتوحا تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية المبيد للجراثيم لمدة 10 دقائق.
ثم ضع 60 ميكرولترا من الفبرونيكتين على السطح غير المميز لزلة الغطاء داخل دائرة سنتيمتر واحد ، مع التأكد من أن مساحة الدائرة بأكملها مغلفة. ضع الأطباق في الحاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد فترة الحضانة ، قم بشفط الفينين بعناية من كل زلة غطاء.
بعد ذلك ، أضف 250 ميكرولتر من وسط الاستزراع إلى المنطقة المطلية FI nin. ينزلق الغطاء ، ثم ينزلق الغطاء مرة أخرى حتى يتم عزل الأنابيب العصبية. أثناء احتضان زلات الغطاء ، املأ طبق بتري زجاجي بطول خمسة سنتيمترات بوسط L 15.
الآن انقل جميع جذوع الأجنة المحتضنة إلى طبق بتري المجهز. استخدم ملقطا دقيقا وألسنة وإبرة حادة لتشريح الأنبوب العصبي عن طريق التقطيع بعناية على طول حدود الأنبوب العصبي والجسيدات بالإبرة. قم بإزالة زلات الغطاء من الحاضنة.
حدد ستة من أطول الأنابيب العصبية وأكثرها استقامة، ثم باستخدام طرف ماصة صغيرة معدة بوسط استزراع، انقل أنبوبا عصبيا واحدا إلى كل من زلات الغطاء الست. تأكد من أن كل أنبوب عصبي يقع داخل المنطقة المطلية بالفيبرونيكتين من زلة الغطاء الخاصة به باستخدام ماصة دقيقة واحتضان طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، ضع ما لا يقل عن ملليلترين من وسط الثقافة بدون مصل في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل.
اترك ربلة الساق مفككة قليلا أثناء احتضان الأنبوب طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون للسماح بضبط درجة الحموضة في الوسط. بعد الثقافة الليلية ، حدد أفضل ثلاث مزارع لخلايا القمة العصبية التي لها حافة مستقيمة طويلة واحدة على الأقل خارج الثقافات الثلاث. اختر واحدة لتحميل الغرفة الأولى وأعد الغرف الأخرى إلى الحاضنة لاستخدامها لاحقا.
ثم باستخدام قطعة القطن الخاصة بنا ، ضع طبقة رقيقة متساوية من الفازلين على المناطق المحيطة بالخزانات وجسر غرفة سيجموند المعدلة. بعد ذلك باستخدام إبرة التنغستن ، قم بإزالة الأنبوب العصبي برفق من زلة الغطاء التي تحتوي على ثقافة خلية القمة العصبية المحددة ، تاركا خلايا القمة العصبية المحيطة متصلة بطبقة الفبرونيكتين. ضع علامة على الطبق بعلامة معملية لتذكر اتجاه الحدود الأكثر استقامة لثقافة خلايا القمة العصبية.
بعد ذلك ، ضع بضع قطرات من الوسط المحتضن مسبقا على جسر غرفة zigmund المعدلة. ثم التقط زلة الغطاء بالملقط الدقيق. ربت على حافة زلة الغطاء على مسح كيم لإزالة معظم وسط الثقافة القديم ، ثم ضع زلة الغطاء على الفور على غرفة التعرج المعدلة بحيث تتمركز حدود خلية القمة العصبية المستقيمة المراد تصويرها على طول الجسر وعموديا تقريبا على حدود خزان الجسر.
باستخدام مجهر مقلوب ، انقل حدود خلية القمة العصبية المستقيمة إلى جانب الجسر الأقرب إلى الخزان. سيحتوي ذلك على اللباقة الكيميائية المشتبه بها ومحاذاة حدود خلية القمة العصبية المستقيمة بشكل عمودي على حدود خزان الجسر. الآن اضغط بعناية ولكن بإحكام على الغطاء ، وانزلق إلى الفازلين الموجود في غرفة zigmund ، وتأكد من إغلاقه تماما في الغرفة.
ثم ضع فازلين إضافيا على طول حافة زلة الغطاء للتأكد من أنها ستكون محكمة الإغلاق. اضبط زاوية حدود خلية القمة العصبية مرة أخرى لتصحيح أي حركة أثناء عملية السقف. بعد ذلك ، قم بتحميل ما يقرب من 300 ميكرولتر من الوسط المحتضن مسبقا في حقنة سعة مليلتر واحد.
مع إبرة متصلة بمقياس 25 × 1.5 بوصة. حقن الوسط في الخزان الذي لن يحتوي على أي لباقة كيميائية حتى تمتلئ. الحرص على عدم توليد أي فقاعات في الخزان.
ثم قم بتوصيل الخزان على كلا الجانبين بكمية كافية من الفازلين قبل تحميل الخزان التالي. الآن قم بتحميل حقنة ثانية ب 300 ميكرولتر من الوسط المحتضن مسبقا الذي يحتوي على اللباقة الكيميائية المطلوبة. ثم حقن الوسيط في الخزان المعاكس بنفس الطريقة.
مرة أخرى ، إغلاق الخزان بعناية مع الفازلين. بعد احتضان غرفة سيغموند المحملة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة قبل التصوير. ثم أثناء الحضانة عند صورة 37 درجة مئوية تقريبا ، وهي الحدود الأكثر استقامة لثقافة خلايا القمة العصبية لمدة ثلاث ساعات على فترات 92 للضوابط ، قم بتحميل غرف زيجموند تحتوي على كل من أفضل ثقافتين أخريان لخلايا القمة العصبية كما هو موضح للتو.
استخدام علاجات التحكم المناسبة لملء الخزانات وتهيئة الجسر. استخدم المكون الإضافي للصورة J الدليل الإضافي لتتبع هجرة خلايا القمة العصبية الطرفية على طول الحدود المستقيمة للثقافة. استخدم المكون الإضافي لأداة الانجذاب الكيميائي والترحيل لتحليل المعلمات المختلفة لمسارات الهجرة التي تم الحصول عليها.
تم تحضير مزارع خلايا القمة العصبية للجذع الممدود عن طريق زراعة الأنابيب العصبية بين عشية وضحاها وتم اختيار مزارع خلايا القمة العصبية الناتجة بحدود مستقيمة طويلة واحدة على الأقل للتجريب. ثم تم وضع أطول حد مستقيم لثقافة مختارة بشكل عمودي على حدود خزان الجسر ، وبالتالي موازية لمتجه التدرج المطبق في المستقبل. تم تحميل الخزان الذي لم يحتوي على الجاذب الكيميائي المشتبه به الممثل هنا بعلامة ناقص أولا وإغلاقه.
ثم تم تحميل الخزان الآخر بجاذب العلاج الكيميائي المشتبه به الممثل بعلامة زائد ثم تم تصوير خلايا القمة العصبية الطرفية المختومة على طول الحدود المحددة مسبقا وتتبعها باستخدام المكون الإضافي للتتبع اليدوي للصورة J. يمكن تقييم العديد من خصائص الهجرة استجابة للتدرج المطبق بناء على بيانات التتبع التي تم الحصول عليها كما هو موضح في هذا الرسم البياني. على سبيل المثال ، يمكن اشتقاق مؤشر الانجذاب الكيميائي عن طريق قسمة إزاحة الخلايا على طول المحور x على المسافة الإجمالية التي هاجرتها. تظهر الاستجابة الجذابة لجميع الخلايا التي يتم تتبعها من خلال مخطط مسار الخلية الموضح هنا.
كل مسار أحمر هو مسار خلية هاجرت نحو الخزان المحملة بجاذب كيميائي مشتبه به. في هذا الشكل ، هناك كمية أكبر بكثير من المسارات الحمراء مقارنة باللون الأسود. في اختبار آخر ، تم التحقق من صحة قدرة غرفة سيجموند المعدلة على الحفاظ على التدرج الجزيئي.
تمت إضافة مترافق Alexa Fluor 4 88 IGM إلى الخزان الأيسر وتم قياس شدة التألق عبر الجسر في أوقات مختلفة. بقي التدرج لمدة 26 ساعة على الأقل بعد مشاهدة الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل قدرة الجزيء على استنباط الانجذاب الكيميائي والسلوكيات المهاجرة الأخرى في مزارع خلايا القمة العصبية للجذع المزروعة باستخدام مقايسة غرفة زيجموند المعدلة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة لتحليل هجرة الخلايا العصبية القمية المنزعجة. النهج فعال من حيث التكلفة ويسمح بتمييز الكيمياء الخلوية عن التأثيرات المهاجرة الأخرى.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- بيولوجيا التطور
الخلفية
- الخلايا العصبية القمية الجذعية ضرورية للعديد من عمليات التطور.
- فهم هجرتها يمكن أن يوفر رؤى في بيولوجيا التطور.
- الطرق الحالية لدراسة هجرة الخلايا قد تكون مكلفة أو معقدة.
- تقدم هذه الدراسة بديلًا أبسط للباحثين.
هدف الدراسة
- لتقييم قدرة الجزيئات على تحفيز الكيمياء الخلوية في الخلايا العصبية القمية.
- لتمييز بين أنواع مختلفة من الاستجابات المهاجرة.
- لتوفير طريقة موثوقة لدراسة ديناميكيات هجرة الخلايا.
الطرق المستخدمة
- عزلة الأنبوب العصبي على مستوى الجذع من الأجنة.
- زراعة الأنابيب العصبية على شرائح تغطية مغلفة بالفيبرونيكتين.
- تركيب المزروعات في غرفة زيغموند المعدلة.
- توليد التدرجات الجزيئية وتصوير هجرة الخلايا.
- تتبع وتحليل الهجرة باستخدام برنامج Image J.
النتائج الرئيسية
- نجحت الطريقة في تمييز الكيمياء الخلوية عن التأثيرات المهاجرة الأخرى.
- تم تحقيق تصور واضح لأنماط هجرة الخلايا.
- قدم برنامج Image J تحليلًا فعالًا لبيانات الهجرة.
- النهج قابل للتكرار ويمكن الوصول إليه للباحثين.
الاستنتاجات
- تقدم هذه الطريقة طريقة جديدة لدراسة هجرة الخلايا العصبية القمية.
- يمكن تطبيقها على أسئلة بحثية مختلفة في بيولوجيا التطور.
- قد يكون للنتائج آثار على فهم سلوك الخلايا في سياقات مختلفة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This method enables cost-effective evaluation of chemotactic responses in primary neural crest cells without requiring homogenous distribution or harsh dissociation, preserving physiological relevance. It supports early-stage target validation by quantifying directional migration in response to molecular gradients, informing mechanistic de-risking of guidance cues. The approach enhances predictive confidence in lead identification for neurodevelopmental and regenerative biology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by assessing whether candidate molecules alter neural crest cell directionality or speed.
- Operational Value: Uses minimal biological material (two neural tube explants per replicate) and avoids enzymatic dissociation, reducing variability and preserving native cell state.
- Predictive Value: Enables quantification of chemotaxis index and trajectory analysis to prioritize compounds with genuine directional activity over random motility.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates stable, measurable molecular gradients across a defined interface for consistent chemotactic stimulation.
- Quantitative Output: Produces trackable migratory parameters (displacement, velocity, persistence) via ImageJ plugins for objective comparison.
- Scalability: Compatible with time-lapse imaging and multi-condition testing using control and experimental reservoirs.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models a developmental system where aberrant migration contributes to neurocristopathies, supporting phenotypic screening relevance.
- Translational Continuity: Maintains cells in a native-like spatial arrangement, improving extrapolation to in vivo migration pathways.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes chemotactic from chemokine or haptotactic effects by isolating gradient-dependent responses.
Pipeline & Workflow Integration
Fits within early discovery workflows following target engagement and preceding phenotypic screening, providing functional validation of migratory modulation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking molecular guidance cues to directional cell movement in a primary stem cell-derived system.
- Screening: Delivers reproducible, gradient-based stimulation enabling reliable compound evaluation in a primary cell context.
- Analytics: Outputs chemotaxis index and trajectory data to quantify directional bias and compare conditions objectively.
- Translational Research: Connects to preclinical validity by using a disease-relevant cell system whose migration mirrors embryonic patterning.
- Enterprise Reuse: Establishes a low-cost, reusable platform for screening multiple guidance cues across projects without reformatting.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating gradient-directed migration from general motility in a primary cell model.
- Operational Value: Standardizes assay conditions through controlled gradient generation and time-lapse imaging, enhancing reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying compounds with authentic chemotactic activity early, reducing investment in false positives.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads based on functional migration data in a developmentally relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in avian embryo handling, neural tube dissection, and primary cell culture maintenance.
- Depends on inverted microscopy with environmental control and ImageJ with manual tracking and chemotaxis analysis plugins.
- Necessitates standardization of gradient application timing and chamber sealing to prevent medium exchange or evaporation artifacts.
- Adaptation to mammalian systems may require optimization of explant culture conditions and substrate coating.
- Limited to adherent, migratory cell populations at culture edges; not applicable to non-polarized or suspension cultures.
