أتمتة التجارب رقاقة وما يليها لتوليد الملامح جينية على خلايا هيلا 10،000

الهدف العام من هذا الإجراء هو تزويد الباحثين بمنصة آلية قادرة على إجراء تجارب الترسيب المناعي للكروماتين على 10000 خلية فقط. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير الكروماتين المنفصم عالي الجودة أولا لترسيب الكروماتين المناعي. في الخطوة الثانية ، يتم إنشاء تجربة ترسيب مناعي آلي للكروماتين ويتم تشغيل المكتبات الآلية باستخدام الحمض النووي المترسب المناعي.

يتم تحليل الحمض النووي المترسب المناعي عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي وتسلسل الجيل التالي. في النهاية ، يمكن التحقق من نجاح التكنولوجيا الآلية من خلال مقارنة ملامح تسلسل الترسيب المناعي للكروماتين التي تم إنشاؤها على عينة الخلية الأصلية المكونة من 10،000 مع التجارب التي أجريت على 100،000 خلية ومجموعات البيانات الحالية للرجوع إليها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال اللاجيني لتعزيز فهمنا لوظائف المؤشرات الحيوية المحددة في الأنسجة المختلفة.

مراحل التطور وحالات المرض. هذه التقنية لها آثار على تشخيص أمراض متعددة لأنها ستساعد في تحديد المؤشرات الحيوية اللاجينية في الصحة والمرض ، دقيقة وموثوقة. تعد التقنيات الآلية أدوات مهمة للباحثين في التحليل اللاجيني لأنواع معينة من الخلايا والمجموعات السكانية الفرعية والخزعات.

بالنسبة لتجربة الترسيب المناعي الآلي القياسي للكروماتين ، ابدأ بإضافة 120 ميكرولترا من المخزن المؤقت للترسيب المناعي للكروماتين H إلى 100 ميكرولتر من الكروماتين المنفصم من واحد إلى 2 مليون خلية ، مع الاحتفاظ باثنين إلى 20 ميكرولتر من الكروماتين لعينة الإدخال. ثم لإعداد التجربة الآلية على بروتوكولات IP star المدمجة ، حدد بروتوكولات وانقر على أيقونة الترسيب المناعي للكروماتين. اختر الطريقة المباشرة للترسيب المناعي للكروماتين ، ثم في الشاشة التالية ، اختر بروتوكول الترسيب المناعي للكروماتين 200 ميكرولتر وحدد رقم العينة.

اضبط المعلمات التجريبية لترسيب مناعي الكروماتين على أربع ساعات لطلاء الجسم المضاد. الخطوة 15 ساعة لخطوة الترسيب المناعي ، وخمس دقائق لكل خطوة غسيل. ثم قم بإعداد الكواشف باتباع التعليمات المعروضة على شاشة معلومات التخطيط ، وأضف الكواشف المناسبة والأجسام المضادة من درجة ChIP-seq التي تم التحقق من صحتها بدرجة عالية.

ثم أضف 20 ميكرولترا من البروتين ، وخرز مغناطيسي مغلف لكل تفاعل ، وتنتهي عينات الكروماتين بعد بروتوكول الرقاقة الليلية والربط المتقاطع العكسي. تنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي القائمة على الخرزة المغناطيسية. استخدم مقايسة مترية فلورية تجارية عالية الحساسية لتحديد الحمض النووي المترسب المناعي.

بعد ذلك ، استخدام البادئات لمنطقة جينومية موجبة واحدة على الأقل ومنطقة جينومية سلبية واحدة. تحليل جودة الحمض النووي المترسب المناعي عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي وفقا للمعايير المناسبة للمواد للتحليل. يتم التعبير عن النتائج كنسبة مئوية من استرداد المدخلات لتسلسل الجيل التالي بموجب البروتوكولات.

انقر الآن على أيقونة إعداد المكتبة ، ثم اختر تقنية إعداد المكتبة المفضلة وقم بإعداد الكواشف وفقا للتعليمات الموجودة على شاشة معلومات التخطيط. على سبيل المثال ، في هذه التجربة ، تم إنشاء ملفات تعريف التسلسل لستة تعديلات مختلفة من الهيستون المرتبطة بالتعبير الجيني. يشير ارتباط الذروة العالي الذي لوحظ بين علامات الهيستون هذه إلى قدرة النظام الآلي على توليد بيانات دقيقة وموثوقة.

علاوة على ذلك ، توضح هذه الرسوم البيانية توزيع القمم لتعديلات الهيستون المختلفة في مناطق جينومية محددة. أخيرا ، بالنسبة لتجربة الترسيب المناعي الآلي للكروماتين للعينات ذات الأعداد المنخفضة من الخلايا ، قم بتعيين بروتوكول الترسيب المناعي الآلي للكروماتين 200 ميكرولتر على نظام الأتمتة كما هو موضح للتو. بعد ذلك ، قم بتحميل النظام ب ChIP-seq ، والأجسام المضادة والكواشف لتحسين العمل على كميات الكروماتين بين 10 ، 000 و 100 ، 000 خلية باستخدام 10 ميكرولترات فقط من البروتين ، حبات مغناطيسية مطلية لكل تفاعل.

بعد الشريحة، قم بتشغيل إعداد المكتبة، وحدد بروتوكول إعداد مكتبة micro plex وقم بإعداد الكواشف باتباع الإرشادات المعروضة على شاشة معلومات التخطيط. في هذا PCR الكمي التمثيلي لترسيب مناعي للكروماتين من عينة تبدأ من 10 ، 000 خلية ، لوحظ تخصيب كبير بالأجسام المضادة للهيستون في مناطق التحكم الإيجابية وإشارات ضئيلة في مناطق التحكم السلبية. هنا يتم عرض سلسلة من 10 تفاعلات ترسيب مناعي كانت قابلة للتكرار وقابلة للمقارنة بشكل كبير مع تجربة الترسيب المناعي للكروماتين اليدوية ، مما يوضح قدرة النظام الآلي على العمل بكميات منخفضة من الخلايا دون زيادة ملحوظة في التجربة لتجربة التباين مقارنة بالترسيب المناعي اليدوي.

توضح هذه البيانات تحليلات المعلوماتية الحيوية لمكتبات التسلسل من 10 و 000 و 100 ، 000. إنه خلايا S3 بعد الترسيب المناعي للكروماتين ، مما يدل على نتائج رائعة من عينات الترسيب المناعي للكروماتين ذات العدد المنخفض للخلايا. تحتوي مجموعة البيانات هذه ، التي تتوافق مع التجربة التي أجريت على 10،000 خلية من المواد الأولية ، على ضوضاء خلفية منخفضة مع قمم تخصيب موثوقة للغاية يتم تأكيدها بواسطة كل من مجموعة بيانات 100،000 خلية ومجموعة البيانات المرجعية لمعهد برود.

بالنسبة لمشروع التشفير ، من المهم ملاحظة أن بيانات الخلية 10 ، 000 تظهر قمم متطابقة تقريبا لبيانات Broad Institute مع نسبة تداخل 98٪ لأفضل 40٪ من القمم المصنفة حسب النتيجة المهمة كما هو مستخدم في مشروع الكود النهائي. يتطلب النظام الآلي IP star الحد الأدنى من تدخل المشغل ، مما يقلل من وقت التدريب العملي لترسيب المناعة للكروماتين إلى ساعة إلى ساعتين فقط. بالإضافة إلى ذلك ، تحل العملية الآلية محل الخطوات العديدة المعرضة للخطأ في الترسيب المناعي اليدوي للكروماتين ، وتقدم نتائج متسقة للغاية.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن ترسيب مناعي الكروماتين الجيد والاختيار الجيد للأجسام المضادة شديدة التحديد والحساسية هو مفتاح نجاح التجربة. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في كل مجال من مجالات علم الأحياء لتحسين دقة العلاج وقابليته للتكرار واتساقه. دراسات علم التخلق.