تحريض الفئران المعوية التهاب عن طريق نقل بالتبني من المستجيب CD4 ⁺ CD45RB ^عالية خلايا T في الفئران العوز المناعي

الهدف العام من هذا الإجراء هو إحداث التهاب معوي عن طريق النقل بالتبني للخلايا التائية الساذجة إلى فئران تعاني من نقص المناعة. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الخلايا أولا عن طحال الفئران ، وتحلل خلايا الدم ثم إثراء السكان لأربع خلايا تائية إيجابية للقرص المضغوط الخطوة الثانية هي تسمية هذه الخلايا بالأجسام المضادة المترافقة DI الفلورية الأربعة و CD 45 RB.

بعد ذلك ، يتم فرز الخلايا المسماة باستخدام الحقائق إلى CD 45 و RB low و CD 45 RB المرتفع. الخطوة الأخيرة هي نقل الخلايا المرتفعة CD 45 RB إلى فئران تعاني من نقص المناعة عن طريق الحقن داخل الصفاق. في النهاية ، يتم تنشيط الخلايا المنقولة وتسبب تلفا في الأنسجة المحلية في غياب الخلايا التنظيمية التائية مما يؤدي إلى التهاب القولون التجريبي.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في دراسة أمراض الأمعاء الالتهابية مثل دور مجموعات خلايا معينة والجراثيم المعدية المعوية في التسبب في المرض. بعد القتل الرحيم للفأر المتبرع ، رش البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول لتعقيم المنطقة. ثم قم بعمل شق أفقي عبر البطن وقشر الجلد لكشف الصفاق باستخدام الملقط.

امسك الصفاق بعيدا عن الأعضاء الداخلية وقم بعمل شق في الصفاق البطني الأيسر. بعد ذلك ، قم باستئصال الطحال من الفأر وضعه في طبق بتري يحتوي على 10 مل من الجليد البارد ، وسط كامل. سحق الطحال بشريحتين زجاجيتين معقتين لعمل تعليق خلية واحدة.

قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة 70 ميكرون في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر ثم اشطف المصفاة بخمسة ملليلتر من سلالة متوسطة كاملة تصل إلى خمسة طحال في أنبوب مخروطي واحد. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 450 مرة G لمدة سبع دقائق عند أربع درجات مئوية. قم بشفط المادة الطافية في حاوية نفايات ثم أعد تعليق الخلايا برفق في 10 ملليلتر من محلول الملصقات المثلج.

اجمع بين 20 ميكرولترا من تعليق الخلية مع 180 ميكرولترا من محلول أزرق 0.4٪ واحتضان الخلايا لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 10 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى مقياس الخلوي الدموي واحسب عدد الخلايا غير الزرقاء تحت المجهر لبدء حبيبات التخصيب وإعادة التدوير برفق ، الخلايا برفق في مخزن مؤقت لوضع العلامات على الجليد بتركيز 20 في 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر. أضف خمسة ميكرولترات من الأجسام المضادة لتخصيب الخلايا التائية المضغوطة المضغوطة بأربعة خلايا تائية لكل مرة واحدة في 10 إلى الخلايا الست ، ثم احتضان الخلايا على الجليد بالجسم المضاد لمدة 15 دقيقة.

أضف 10 أضعاف حجم المخزن المؤقت لوضع العلامات إلى تعليق الخلية ، ثم قم بالطرد المركزي للخلايا عند 450 مرة G لمدة سبع دقائق. شفط المادة الطافية بعناية دون إزعاج حبيبات الخلية. بعد ذلك ، أعد تعليق الجسيمات المغناطيسية المترافقة مع الستربتافيدين عن طريق الدوامة وإضافة خمسة ميكرولترات من الجسيمات لكل مرة واحدة في 10 إلى الخلايا الست في الخلايا.

امزج الجزيئات مع الخلايا عن طريق تحريك الأنبوب برفق ثم احتضان الخليط عند درجة حرارة ست إلى 12 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أعد تعليق الخلايا إلى تركيز 20 إلى 80 مرة 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر مع مخزن مؤقت لوضع العلامات. ثم انقل ملليلترا واحدا من الخلايا المصنفة إلى أنبوب اختبار دائري القاع مقاس 12 ملم × 75 ملم وضع أنبوب الكسر الموجب هذا على مغناطيس لمدة ست إلى ثماني دقائق.

باستخدام الأنبوب الموجود على المغناطيس ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة زجاجية دون إزعاج الخلايا المسماة ونقلها إلى أنبوب مخروطي معقم جديد سعة 50 ملليلترا. يحتوي هذا الكسر على الخلايا التائية الأربع موجبة للقرص المضغوط . قم بإزالة أنبوب الكسر الموجب من المغناطيس وأعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت لوضع العلامات عن طريق سحب العينات بقوة.

أعد الأنبوب إلى المغناطيس لمدة ست إلى ثماني دقائق أخرى. مرة أخرى ، انقل SUP nain بعناية إلى أنبوب الكسر المخصب. قم بزيادة إنتاجية الخلايا التائية الموجبة المضغوطة عن طريق تكرار التخصيب حسب الضرورة لإعداد الخلايا لوضع العلامات أولا ، وقم بالطرد المركزي للجزء المخصب عند 450 مرة G لمدة سبع دقائق وتخلص من المادة الطافية.

ثم أعد تعليق الخلايا في مخزن مؤقت الملصقات إلى تركيز 10 في 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر. Aliquot خمسة في 10 من الخلايا الخامسة في أنابيب fuge الدقيقة الفردية لخلايا التحكم الملطخة بالنظائر غير الملطخة والخلايا المفردة الملطخة. ثم أضف خمسة ميكروغرام لكل مليلتر من CD أربعة و FE وميكروغرام واحد لكل مليلتر من الأجسام المضادة CD 45 RB PE إلى الأنبوب الذي يحتوي على تعليق الخلية الأصلي.

أضف بقع التحكم في النظائر والبقع المفردة بنفس التركيز إلى حصص الخلية المناسبة. امزج الخلايا برفق مع الأجسام المضادة ثم احتضن الأنابيب على الجليد لمدة 30 دقيقة. قم بتغطية الأنابيب لحمايتها من الضوء.

بعد ذلك ، اغسل الخلايا مرتين في المخزن المؤقت لوضع العلامات كما هو موضح في بروتوكول النص وأعد تعليق الخلايا عند 10 أضعاف 10 من الخلايا الست لكل مليلتر في المخزن المؤقت لوضع العلامات. ثم مرر تعليق الخلية عبر مصفاة 70 ميكرون في أنبوب فاكس. ضع الأنبوب على الثلج وقم بتغطيته لمنع تبييض البقع.

استخدم خلايا التحكم غير الملوثة وأحادية المرحلة لمعايرة التعويض على فارز الخلايا. استبعاد الخلايا غير القابلة للحياة باستخدام بوابات متناثرة أمامية وجانبية. ثم اضبط البوابة على القرص المضغوط أربعة موجبة و CD أربع خلايا موجبة RB مع عناصر التحكم الملطخة بالنظائر

البوابة التالية ، القرص المضغوط أربعة مجموعات إيجابية ثم فرز الخلايا إلى CD 45 و RB high و CD 45 RB منخفضة. اجمع الخلايا في أنابيب تحتوي على ملليلترين من الوسط الكامل ثم قم بتشغيل حصة من حوالي 10 أضعاف 10 إلى الخلايا الثالثة من كل جزء على فارز الخلية لتقييم نقاء العينة لإعداد خلايا CD 45 RB عالية و CD 45 RB منخفضة لغسلها بالحقن وإعادة تعليقها في PBS إلى كثافة الخلية المناسبة كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك ، قم بتقييد الفأر المتلقي بقوة وحقن 100 ميكرولتر من تعليق الخلية داخل الصفاق في الجانبين الأيمن والأيسر من البطن.

راقب الفئران المتلقية بحثا عن المعلمات السريرية كما هو موضح في البروتوكول النصي كل أسبوع. عادة ما يكون تطور المرض بعد الحقن واضحا في الأسبوع الخامس. التضحية بالفأر في نقطة زمنية محددة مسبقا أو عندما يفقد 20٪ من وزن الجسم الأولي واستخرج القولون.

ثم قم بقياس وتسجيل طول ووزن القولون. تم نقل الخلايا التائية المضغوطة المضغوطة الإيجابية CD 45 RB إلى خرقة بالضربة القاضية و NFIL ، وثلاثة RAG ، والفئران المتلقية بالضربة القاضية المزدوجة ، بخمسة أسابيع بعد الحقن. فقدت الفئران بالضربة القاضية المزدوجة 10٪ من وزن جسمها الأولي ، ونقطتين من كل من خرقة المغلوب والضربة القاضية المزدوجة.

تم تكثيف الفئران المتلقية وتقصيرها مقارنة بالقولون من الفئران الضابطة CD أربعة خلايا CD 45 RB عالية التائية الإيجابية للنقل إلى خرقة خرقة واحدة بالضربة القاضية وخرقة المغلفة واحدة P واحد 10 دلتا متلقي يشير التحليل النسيجي في ثلاثة أسابيع بعد النقل إلى تضخم ظهاري ، وتسلل الخلايا الالتهابية وخراجات القبو في قطعة قماش واحدة بالضربة القاضية دلتا متحولة متلقين ولكن ليس خرقة واحدة فئران بالضربة القاضية بمجرد إتقانها. يمكن إجراء هذه التقنية في غضون أربع إلى ست ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.