نظم هيلا خلية استنادا حرية التعبير للتعبير عن المتصورة المقيرع البروتينات

الهدف العام من التجربة التالية هو ترجمة بروتينات المتصورة باستخدام أنظمة التعبير الخالية من الخلايا القائمة على hela وتنقية البروتينات من الأحجام الصغيرة للمنتج المترجم. يتم تحقيق ذلك عن طريق استنساخ جينات المتصورة لإعداد البلازميدات المؤتلفة لخطوتين وخطوة واحدة في الترجمة المختبرية ، والتعبير الخالي من الخلايا لبروتينات شجرة RT المؤتلفة للملاريا. لترجمة البروتينات المؤتلفة ، يتم تحضين البلازميد المحضر بمزيج النسخ.

عند استخدام نظام التعبير المكون من خطوتين ، والذي ينسخ mRNA ، تتم إضافة mRNA الناتج إلى مزيج الترجمة لترجمة البروتين. أثناء استخدام نظام التعبير بخطوة واحدة ، يتم تحضين البلازميد المؤتلف مع محللة خلية هيلا لنسخ وترجمة البروتينات المؤتلفة. ثم يتم تنقية البروتينات المؤتلفة من الأحجام الصغيرة لمنتج الترجمة.

أظهرت النتائج التعبير والتنقية الناجحين بناء على تحليل النشاف الغربي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على غيرها ، مثل نظام التعبير عن جنين القمح ونظام محللة الخلايا الشبكية للأرانب هي أن هذا النظام يمكنه التعبير عن البروتينات في ثلاث ساعات. لا يلزم تحسين الترميز.

إنه ميسور التكلفة وسهل الاستخدام. يمكن فحص مستضدات متعددة على المصفوفات الدقيقة مما يجعل اكتشاف المستضدات للعلاج والتشخيص ممكنا. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنها تعبير خال من الخلايا ، والذي يعبر عن البروتينات بأحجام صغيرة مما يجعل تنقية البروتين أمرا صعبا للغاية.

كانت لدينا أولا فكرة لاستخدام هذا النظام حيث لم نتمكن من تفجير البروتينات عبر الإنترنت باستخدام الإشريكية القولونية ووجدنا أن أنظمة التعبير الأخرى باهظة الثمن وتستغرق وقتا طويلا. قررنا استكشاف نظام التعبير الخالي من الخلايا القائم على hela كنظام بديل. قم بإعداد 20 ميكرولترا من خليط النسخ الذي يحتوي على الحمض النووي المتجه البلازميد المؤتلف كما هو موضح في بروتوكول النص لتعبير البروتين البشري في المختبر المكون من خطوتين.

استخدام قوالب الحمض النووي. امزج المكونات في أنبوب طرد مركزي دقيق واحتضانها لمدة 75 دقيقة عند 30 درجة مئوية في حمام مائي. ثم خذ ميكرولترين من خليط النسخ وأضفه إلى 23 ميكرولترا من خليط الترجمة الذي يحتوي على محللة خلية هيلا.

احتضان الخليط الناتج عند 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. قم بتخزين المنتجات المترجمة على درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. بعد ذلك ، قم بإعداد 25 ميكرولترا من خليط النسخ والترجمة الذي يحتوي على ناقل البلازميد المؤتلف ، والحمض النووي ، وهو محللة كما هو موضح في بروتوكول النص لخطوة واحدة بشرية مقترنة بالتعبير عن بروتين الترجمة في المختبر لقوالب الحمض النووي.

احتضان خليط التفاعل هذا لمدة 90 دقيقة إلى ست ساعات عند 30 درجة مئوية وقم بتخزين منتجات الترجمة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. لتنقية البروتينات المؤتلفة المعبر عنها ، أضف 75 ميكرولترا من مخزن تنقية X واحد إلى 25 ميكرولتر من منتج الترجمة لصنع 100 ميكرولتر من خليط التنقية. اغسل راتنج النيكل مرتين بإضافة 300 ميكرولتر من الماء المقطر و 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم.

أعد تعليق الراتنج وأجهزة الطرد المركزي عند 14 ، 000 Gs لمدة دقيقة واحدة لإزالة الإيثانول الزائد. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من محلول التنقية المحضر إلى 100 ميكرولتر من راتنج مخلب النيكل ، واحتضن الخليط في النهاية. شاكر نهاية لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بالطرد المركزي للخليط عند 14،000 Gs لمدة دقيقة واحدة واجمع السوبر في أنبوب جديد يسمى التدفق من خلاله. اغسل الراتنج ب 100 ميكرولتر من مخزن غسيل واحد ، ثم جهاز طرد مركزي عند 14 ، 000 GS لمدة دقيقة واحدة واجمع السوبر المسمى في أنبوب جديد يسمى الغسيل. كرر هذه الخطوة مرتين بعد الغسيل.

أضف 100 ميكرولتر من مخزن مؤقت للشطف إلى الراتنج واحتضنه على شاكر نهاية لمدة 15 دقيقة. ثم جهاز الطرد المركزي عند 14 ، 000 جي لمدة دقيقة واحدة. قم بتنفيذ الخطوة Ellucian مرتين في كل مرة.

اجمع المادة الطافية في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وقم بتسميته على أنه تصفية بعد ellucian. اغسل الراتنج مرتين كما كان من قبل ثم قم بتخزينه على أربع درجات مئوية. قم بتخزين التدفق من خلال عينات الغسيل والشطف عند 20 درجة مئوية تحت الصفر أو أقل لإجراء النشاف الغربي.

أولا ، قم بإعداد أنابيب منفصلة من مستخلصات schon من P falsy parum e coli ، وعبر عن ثلاثة بروتينات مؤتلفة R ، والبروتينات المؤتلفة المحضرة ومنتجات البروتين المنقاة باستخدام طريقة التقارب. بعد ذلك ، أضف المخزن المؤقت لعينة الرحلان الكهربائي الذي يحتوي على mercaptoethanol إلى كل أنبوب للحصول على حجم نهائي يبلغ 20 ميكرولترا. لعمل عينات بروتين قابلة للذوبان ، قم بغلي الأنابيب لمدة دقيقتين.

قم بتحميل عينات البروتين القابلة للذوبان على مواد هلامية لصفحة SDS بنسبة 10٪ لفصل البروتينات بعد تشغيل المواد الهلامية. انقل البروتينات المنفصلة من المواد الهلامية لصفحة SDS إلى ورق النيتروسليلوز عن طريق الرحلان الكهربائي عند 35 مللي أمبير من التيار لكل هلام في غرفة نشاف غربية شبه جافة لمدة ساعتين بعد نقل وحظر ورق النيتروسليلوز بحليب خالي من الدسم بنسبة 2٪. احتضان ورقة النيتروسليلوز بالأجسام المضادة متعددة النسيلة المدرجة في بروتوكول النص للضوابط السلبية.

احتضان أيضا ورق النيتروسليلوز في واحد إلى 100 مصل فأر وأرانب عادي مخفف ومستنفق الثقافة التي سميت من SB اثنين من خلايا الورم النخاعي. بعد حضانة ورق النيتروسليلوز عند أربع درجات مئوية ، يتم غسله أربع مرات مع اللطخة العازلة واحتضانه بالأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالأنواع ، مقترنة ببيروكسيداز الفجل الحصاني ، مخفف من واحد إلى 1000 في 2٪ حليب. ثم اغسل ورق النيتروسليلوز مرة أخرى أربع مرات باستخدام لطخة عازلة.

أخيرا ، احتضان ورق النيتروسليلوز المغسول بمحلول تطوير اللون ، A plus B لمدة 30 دقيقة في الظلام ، تم تأكيد التعبير الناجح لبروتينات المتصورة باستخدام أنظمة التعبير الخالية من الخلايا البشرية في المختبر بواسطة Antier للأرانب الخاصة بشجرة RT كما هو موضح سابقا لم يتم التعرف على البروتينات المؤتلفة بواسطة الأمصال المضادة ضد بروتينات vae الطفيلية من p FALs parem و P Yoi Lee ، مما يدل على خصوصية الأرانب المضادة 6 76 ضد البروتينات المعبر عنها. لم يتفاعل مصل الأرانب العادي مع البروتينات المؤتلفة. تمت ترجمته باستخدام نظام التعبير الخالي من الخلايا البشرية في المختبر المكون من خطوتين ونظام الترجمة المختبري المقترن بخطوة واحدة.

هنا تنقية ناجحة للبروتينات المترجمة من 25 ميكرولترا من منتجات البروتين المترجمة. يظهر تنقية ناجحة على وجه التحديد لبروتين الغشاء المشقوق في مارا. كما يظهر التنقية الناجحة لبروتين افتراضي من جينات ترميز بروتين شجرة المتصورة RT.

أخيرا ، يظهر التنقية الناجحة لتكرارات المدرع التي تحتوي على بروتين شجرة المتصورة RT. يبلغ إنتاج البروتين بعد التنقية 3.5 ميكروغرام لكل 25 ميكرولتر بعد تطوره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الطفيليات لتوصيف البروتين في الطفيليات ، وتفاعلات البروتين والبروتين ، والدراسات المثبطة للأجسام المضادة ، وتطوير اللقاحات في مجال علم الطفيليات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تفهم كيفية استخدام نظام التعبير الخلوي الخالي من الخلايا المعالج للتعبير عن بروتينات المتصورة في ثلاث ساعات. سيكون لديك أيضا فهم لكيفية تنقية البروتينات من الأحجام الصغيرة للمنتج المترجم.