التعبير عابرة والخلوية توطين البروتينات المؤتلف في الخلايا مثقف الحشرات

الهدف العام من هذا الإجراء هو التعبير عن البروتينات ذات العلامات الفلورية ذات الأهمية داخل خلايا الحشرات المتاحة تجاريا من أجل توضيح معزز لوظيفة البروتين و / أو الاتجار الخلوي للبروتينات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية لبيولوجيا الخلية والكيمياء الحيوية فيما يتعلق بوظائف البروتين وتفاعلات البروتين و / أو توطين البروتين تحت الخلوي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إنشاء التركيبات بسرعة والتعبير عن البروتينات التي يتم تقييمها وظيفيا في الخلايا الحية دون تأثيرات ضارة مرتبطة بتعبير الفيروس الباكولوجيني ، وبالتالي تحسين الإنتاجية.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في دراسة بروتينات الحشرات ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أي نظام تكون فيه دراسة وظيفة البروتين أو التوطين الخلوي مطلوبة. سيوضح إجراء زراعة خلايا الحشرات وتعداء داني ليروي ، فني من مختبري. لبدء هذا الإجراء ، قم بإزالة قوارير مخزون خلايا SF9 و Tni المجمدة من الفريزر تحت الصفر 80 درجة مئوية واتركها تذوب في حمام مائي 37 درجة مئوية.

بعد الذوبان ، قم بتطهير القوارير بنسبة 70٪ من الإيثانول وضعها على الجليد. يجب إجراء جميع عمليات التلاعب بالخلايا التي تتطلب فتح القوارير وقوارير زراعة الأنسجة داخل غطاء تدفق رقائقي للحفاظ على الظروف المعقمة. أضف أربعة ملليلتر من وسط الحشرات الخالي من المصل إلى قارورة T25 جديدة وأربعة ملليلتر من وسط TNM-FH إلى قارورة T25 أخرى.

انقل ملليلترا واحدا من خلايا Tni المذابة إلى القارورة ذات وسط الحشرات الخالي من المصل ومليلتر واحد من خلايا SF9 المذابة إلى القارورة بوسط TNM-FH. ضع القوارير في حاضنة غير رطبة بدرجة حرارة 28 درجة مئوية واترك الخلايا تلتصق لمدة 30 إلى 45 دقيقة. استبدل وسط البذر بخمسة ملليلتر من الوسط المناسب.

وأعد القوارير إلى الحاضنة غير المرطبة بدرجة حرارة 28 درجة مئوية. راقب التقاء الخلايا يوميا. قم بتمرير الخلايا عندما تصل إلى التقاء 90٪ كما هو موضح في هذه الصور التمثيلية.

قم بإمالة القارورة التي تحتوي على الخلايا المتقاربة بحيث يتدفق الوسط نحو زاوية واحدة بعيدا عن الطبقة الأحادية للخلية واستخدم ماصة مصلية معقمة سعة خمسة ملليلتر لإزالة الوسط بعناية دون إزعاج الخلايا. بالنسبة لخلايا Tni ، استخدم ماصة مصلية معقمة جديدة سعة خمسة ملليلتر لإضافة أربعة ملليلتر من وسط الحشرات الخالي من المصل برفق إلى الطبقة الأحادية المتقاربة. حرك طرف الماصة عبر القارورة وقم بالري ببطء لإزالة الخلايا المتصلة بشكل فضفاض بقاع القارورة.

للتحقق من الانفصال الكافي للخلايا ، قم بإزالة جميع الوسائط ، واقلب القارورة ولاحظ أن الجزء السفلي من القارورة واضح. بالنسبة لخلايا SF9 ، التي تلتصق بإحكام أكبر ، أضف أربعة ملليلتر من وسط TNM-FH الطازج واستخدم مكشطة خلية لإخراج الخلايا المرفقة. استخدم ماصة مصلية سعة خمسة ملليلتر لخلط الخلايا وتقليل تكتل الخلايا برفق.

بعد فصل الخلايا ، انقل ما يقرب من 0.1 مل من كل خلية وخليط متوسط إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 ملليلتر. في أنبوب منفصل 0.5 ملليلتر ، أضف 10 ميكرولتر من كل خلية وخليطا متوسطا إلى 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق. قم بإزالة شريحة حجرة عداد الخلية من عبوتها وأضف 10 ميكرولترات من خليط التريبان الأزرق متوسط الخلية إلى كل جانب من جوانب شريحة العد.

أدخل الشريحة في عداد الخلايا الآلي وحدد كثافة الخلية وقابليتها للحياة. انقل ما يقرب من واحد إلى 1.5 مرة 10 إلى الخلايا السادسة إلى قوارير T25 مع وسائط جديدة. قم بتسمية القوارير بخط الخلية والتاريخ والوسيط المستخدم وعدد الخلايا المضافة ورقم المقطع.

ضع القوارير في حاضنة 28 درجة مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة. يجب أيضا إجراء تعداء خلايا الحشرات داخل غطاء التدفق الصفحي. قم بزرع قارورة T25 مع ما يصل إلى واحد في 10 إلى خلايا Tni أو SF9 السادسة في وسط خلية حشرة مناسب.

تستخدم خلايا Tni في هذا العرض التوضيحي. قم بتنمية الخلايا إلى التقاء لمدة 72 ساعة عند 18 درجة مئوية. بعد 72 ساعة ، قم بإزالة الوسط القديم والتخلص منه وإخراج خلايا Tni بأربعة ملليلتر من وسط الحشرات الطازج الخالي من المصل كما هو موضح سابقا.

أصعب جانب في هذا الإجراء هو الحصول على الكثافة المناسبة للخلايا المتصلة بأطباق القاع الزجاجي أثناء التعداد. لا ينبغي إضافة أكثر من سبعة أضعاف 10 إلى الخلية الخامسة إلى كل طبق. بعد استخدام عداد خلية آلي لتقدير كثافة الخلية ، قم بخلط معلق الخلية جيدا ولكن برفق عن طريق قلب الأنبوب وإضافة ما يقرب من سبعة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة إلى أطباق القاع الزجاجية الفردية مقاس 35 ملم.

اسمح للخلايا بالالتصاق لمدة 20 إلى 25 دقيقة عند 28 درجة مئوية. لكل تعداء ، أضف ميكروغرامين من الحمض النووي البلازميد إلى 0.1 مل من وسط الحشرات الخالي من المصل بدون FBS في أنبوب معقم 1.5 ملليلتر. في أنبوب منفصل ، امزج ثمانية ميكرولترات من كاشف التعدي مع 0.1 مل من وسط الحشرات الخالي من المصل.

ثم انقل المحلول إلى الأنبوب الذي يحتوي على الحمض النووي البلازميد المهم. دوامة برفق واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 إلى 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتخفيف خليط تعداء البلازميد ب 0.8 مل من وسط الحشرات الخالي من المصل ، مما يصل الحجم الإجمالي إلى مليلتر واحد.

قم بإزالة الوسائط بعناية من الطبق الزجاجي الذي يحتوي على خلايا مرفقة. تراكب الخلايا المرفقة بوسط تعداء البلازميد المخفف. احتضان الخلايا عند 28 درجة مئوية لمدة خمس ساعات.

بعد خمس ساعات ، قم بإزالة وسيط التعداء والتخلص منه وغسل الخلايا برفق بمليلتر واحد من وسط الحشرات الخالي من المصل ، مع الحرص على عدم إزاحة الخلايا. أضف ملليلترين من وسط خلية الحشرات الطازجة الخالية من المصل واحتضانها عند 28 درجة مئوية لمدة 48 إلى 72 ساعة. بعد 48 إلى 72 ساعة من تعداء خلايا الحشرات ، اغسل الخلايا مرة واحدة بمليلتر واحد من وسط الحشرات IPL-41 ثم قم بتغطيتها بملليلترين من IPL-41 للتصوير.

أضف أربع قطرات من كاشف تلطيخ الخلايا الحية Hoechst إلى الوسط واحتضنه عند 28 درجة مئوية لمدة 20 إلى 25 دقيقة. ضع الطبق مقاس 35 ملم في المجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر المغلق ذاتيا. على الرغم من أن العديد من الأطباق الزجاجية متوفرة تجاريا ، فمن المهم أن تتناسب مع مرحلة المجهر وقد يكون من الضروري تحديد الأواني الزجاجية الأكثر توافقا مع مرفق الخلية تجريبيا.

اضبط المجهر لظروف مراقبة Hoechst و EGFP و mChery. 359 نانومتر و 461 نانومتر لإثارة وانبعاث Hoechst. 489 نانومتر و 510 نانومتر لإثارة وانبعاث EGFP.

و 580 نانومتر و 610 نانومتر لإثارة وانبعاث mCheric. باستخدام هدف 10X ، قم بإجراء فحص أولي لتأكيد تعبير الفلورسنت. بعد ذلك ، قم بالتبديل إلى وضع المسح باستخدام هدف الغمر في الماء بتباين 60X.

اضبط طاقة الليزر وحساسية الكاشف وسرعة المسح وعمق المحور Z والتقريب الرقمي لتحسين تباين الصورة ودقتها. قم بتصوير الخلايا عند تقريب رقمي 1.5X لإعطاء إجمالي تضخيم 90X. احفظ البيانات الأولية وتصديرها كملفات صور TIFF لتحليلها لاحقا.

تم نقل خلايا Tni باستخدام البلازميدات المشار إليها وتم تصور التعبير عن البروتينات المؤتلفة باستخدام الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر. يتضح التعدي الناجح والتعبير عن BtDrip1-EGFP المؤتلف من خلال وجود مضان أخضر على سطح الخلية. تظهر الخلايا التي تم نقلها باستخدام BtDrip2 الإصدار الأول EGFP تألق أخضر في الداخل مما يشير إلى التعبير داخل الخلايا ل BtDrip2 الإصدار الأول.

وبالمثل ، تظهر الخلايا التي تم نقلها باستخدام PIB DmSPR-mCherry أو PIB PLA2G15-mCherry مضان أحمر يشير إلى التعبير عن الوهم المعني. في الصور المدمجة ، تشير المناطق البرتقالية أو الصفراء إلى التعبير عن كل من EGFP و mCherry مما يشير إلى أن البروتينات موضعية داخل نفس الهياكل تحت الخلوية. يقترح تراكب الخلايا المزدوج الذي تم نقله باستخدام PIB BtDrip1-EGFP و PIB DmSPR-mCherry توطين مشترك ل BtDrip1-EGFP و DmSPR-mCherry على سطح الخلية.

تظهر الخلايا التي تم نقلها بشكل مزدوج باستخدام الإصدار الأول من BtDrip2 EGFP و PIB DmSPR-mCherry القليل من التوطين المشترك لإشارات التألق الأخضر والأحمر التي تؤكد التعبير داخل الخلايا ل BtDrip2 الإصدار الأول. في المقابل ، أدى التعبير المشترك ل PIB BtDrip2 الإصدار الأول EGFP وعلامة الليزوزومات PIB PLA2G15-mCherry إلى تداخل كبير في إشارات الفلورسنت السيتوبلازمية الخضراء والحمراء. يشير هذا بقوة إلى أن BtDrip2 هو حركة مرور إلى الجسيمات الحالة بين الخلايا.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعبير عن كيميرا البروتين الفلوري داخل خلايا الحشرات المستنبتة. يوفر هذا النظام بناء سريعا للنواقل في تخليق البروتين ، ويتجنب تحديات أنظمة التعبير القائمة على الفيروسات ، ويوفر وسيلة قوية لمراقبة بروتينات الاتجار الخلوي.