العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

يتمثل الهدف العام من اختبار تهيج العين في تصنيف وترميز المواد والمخاليط وفقاً لقدرتها على إحداث تهيج في العين. يعتمد هذا الإجراء على نموذج نسيجي ثلاثي الأبعاد مُعاد بناؤه يشبه القرنية. عند وصول مجموعة الاختبار، يتم تحضينها مسبقاً طوال الليل في وسط المقايسة، وفي اليوم التالي، يتم ترطيب الأنسجة، يليه التطبيق الموضعي لعناصر التحكم الإيجابية والسلبية والمواد الكيميائية المراد اختبارها على أسطح الأنسجة في مكررات ثنائية.

بعد فترة محددة من التعرض، يتم إزالة المواد الكيميائية المختبرة عن طريق الغسل. تُحضن الأنسجة لاحقاً في وسط مقايسة جديد، ثم يتم تقييم سمية المواد الكيميائية باستخدام مقايسة MTT. وفي النهاية، يمكن تقدير القدرة التهيجية للمواد المختبرة من خلال مقارنة الحيوية النسبية للأنسجة المعالجة بالمادة المختبرة مقابل الأنسجة المعالجة بضابط سلبي.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل اختبارات تهيج العين السريعة، في أنها لا تتطلب استخدام حيوانات المختبر؛ حيث تعتمد على نموذج نسيجي للقرنية مُعاد بناؤه مخبرياً (in vitro)، يتكون من خلايا بشرية طبيعية. وتعد هذه التقنية قابلة للتطبيق على جميع أنواع المواد والمخاليط، ويمكنها التمييز بين المواد الكيميائية التي تسبب تهيجاً عينياً أو تلفاً جسيماً في العين وبين المواد الأخرى.

المواد غير المهيجة التي لا تتطلب تصنيفاً أو وضع ملصقات تحذيرية. يتم تحضير النسيج الطلائي الشبيه بالقرنية البشرية المعاد بناؤه أو epi. Ocular في إدراجات تحتوي على غشاء مسامي تمر من خلاله العناصر الغذائية إلى الخلايا.

يشكل النسيج المعاد بناؤه ظهارة غير مقّرنة تحاكي ظهارة القرنية بخلايا مجهزة في طبقات تدريجية ولكنها غير متقرنة. عند استلام طقم الخلايا الظهارية الشبيهة بالقرنية البشرية، يتم موازنة الأنسجة في حاوية الشحن ذات الـ 24 بئراً حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. بعد 15 دقيقة، افتح الكيس الذي يحتوي على طبق الأنسجة ذو الـ 24 بئراً تحت ظروف معقمة وافحص جميع الأنسجة للتأكد من عدم وجود فقاعات هواء بين هلام agros والإضافات. قص. افتح الشريط اللاصق.

قم بإزالة الغطاء باستخدام شاش معقم وافحص سطح النسيج. بعد ذلك، وزع 1 mL من وسط المقايسة الخاص بالعدة عند درجة حرارة 37 °C في آبار أطباق سداسية الآبار مجهزة بملصقات تعريفية. ثم استخدم ملاقط معقمة لتجفيف الحواشي التي تحتوي على الأنسجة برفق على شاش معقم لإزالة أي بقايا من محاليل الشحن، وضعها في آبار منفردة من الأطباق سداسية الآبار.

بعد مرور ساعة واحدة، استبدل الوسط بـ 1 mL من وسط المقايسة الطازج عند درجة حرارة 37 °C، واحضر الأنسجة تحت ظروف استزراع قياسية طوال الليل. وفي اليوم التالي، ضع 20 µL من محلول DPBS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم على السطح القمي لكل نسيج. إذا لم ينتشر محلول DPBS عبر الأنسجة، أمسك الحشوة بلطف باستخدام ملقط وقم بالنقر على الطبق لضمان ترطيب المحلول الملحِي لسطح النسيج بالكامل.

يتم تحضين الأطباق لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، ولمعالجة الأنسجة بالمواد المختبرة السائلة، يتم وضع 50 µL من الضابط السلبي، والضابط الإيجابي، والمواد المختبرة المناسبة في مكررات وفقاً للجدول الزمني. يجب الحرص على ضمان تغطية المعالجات لجميع أسطح الأنسجة، ثم يتم تحضين القطع المدمجة لمدة 30 دقيقة لمعالجة الأنسجة بالمواد المختبرة الصلبة.

أولاً، انقل الغرسات إلى سطح معقم. حافظ على تغطية الطبق لمنع التلوث بالجزيئات الصلبة المحمولة جواً. بعد ذلك، وباستخدام ملعقة مستوية، ضع 50 milligrams من المادة المختبرة موضعياً على الأنسجة المكررة وفقاً للجدول الزمني، مع الحرص على أن تغطي المعالجة سطح النسيج بالكامل.

بدلاً من ذلك، استخدم محقنة سعة 1 mL ممتلئة مسبقاً مع قص رأسها، وذلك لوضع المساحيق مباشرة على المزرعة. اضغط على المكبس لتطبيق المسحوق مباشرة بعد وضع مواد الاختبار الصلبة، ثم أعد الأدخالات إلى أطباق الستة آبار الخاصة بها واحضن الأنسجة لمدة ست ساعات لشطفها.

بعد المعالجة، املأ 3 دوارق سعة 150 milliliter لكل مادة اختبار بـ 100 milliliters من DPBS في نهاية فترة تحضين التعريض. أمسك الحافة العلوية للإدراجات باستخدام ملقط منحني لإخراجها من الآبار. ثم استخدم الملقط لالتقاط إدراجين من نفس المعالجة من حوافهما العلوية وصب محاليل المعالجة على مادة ماصة نظيفة.

بعد ذلك، اغمر الحشوات في الدورق الأول من DPBS مع غسل الأنسجة بحركة تدوير دائرية لمدة ثانيتين. ثم ارفع الحشوات بحيث تكون ممتلئة إلى حد كبير بـ DPBS وصب السائل مرة أخرى في الدورق. كرر عملية الغسل مرتين في الدورق الأول.

بعد ذلك، اشطف الإدراجات في الكأسين الثاني والثالث من محلول DPB S ثلاث مرات لكل منهما بنفس الطريقة المتبعة في الغسلة الأخيرة. قم بتدوير كل إدراجة بزاوية 45 درجة تقريبًا بحيث تكون النهاية المفتوحة متجهة للأسفل، ثم المس الحافة العلوية بالمادة الماصة لتصريف أي كمية متبقية من محلول DPBS. بعد ذلك، اغمر الأنسجة فورًا في خمسة ملليلترات (5 mL) من وسط المقايسة في درجة حرارة الغرفة.

في طبق بئر 12 مُصنف مسبقاً، وعند نهاية فترة الغمر بعد النقع، قم بسكب وسط المقايسة وتجفيف الحشوات على مادة ماصة. ثم انقل الحشوات إلى طبق بئر 6 جديد يحتوي على 1 milliliter من وسط المقايسة الدافئ في كل بئر، وضع الأطباق في الحاضنة لبدء مقايسة MTT للحيوية. انقل الحشوات بعد ذلك إلى طبق بئر 24 يحتوي على 0.3 milliliters من محلول MTT المُحضّر حديثاً.

جفف الإدراجات باستخدام مادة ماصة قبل النقل. تخلص من أي فقاعات هواء محتبسة أسفل الإدراجات وأعد الأنسجة إلى الحاضنة بعد ثلاث ساعات، مع وضع قواعد الإدراجات على المادة الماصة. ثم، بالنسبة للاستخلاص المغمور لمواد الاختبار السائلة غير الملونة، اغمر الإدراجات في طبق مسبق التسمية مكون من 24 بئراً يحتوي كل بئر منها على 2 mL من محلول الاستخلاص المناسب، وذلك بالنسبة للاستخلاص غير المغمور للملونات الصلبة أو السائلة.

انقل القطع المجهزة إلى طبق سداسي الفجوات مُصنف مسبقاً يحتوي على 1 mL من محلول الاستخلاص في كل فجوة. بعد ذلك، قم بإغلاق الأطباق باستخدام جهاز ختم حراري أو شريط بارافورم لمنع التبخر، ثم ابدأ عملية الاستخلاص على هزاز مداري لمدة تتراوح بين ساعتين إلى ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة، مع الرج اللطيف في نهاية عملية الاستخلاص بالغمر. قم بثقب الأنسجة ثم صب السائل الموجود داخل كل قطعة في الفجوة، وبعد ذلك تخلص من القطع التي تحتوي على الأنسجة.

امزج محلول المستخلص في كل بئر، وانقل حصتين بحجم 200 microliter من كل عينة إلى الآبار المناسبة في طبق 96 Well مُصنف مسبقاً كما هو موضح في المخطط الموجود في نهاية عملية الاستخلاص غير المغمور. تخلص من الحشوات والأنسجة دون ثقبها، وأضف 1 milliliter من محلول الاستخلاص إلى كل منها. امزج محلول الاستخلاص جيداً في الآبار، وانقل حصتين بحجم 200 microliter من كل عينة إلى الآبار المناسبة في طبق 96 well مُصنف مسبقاً كما تم توضيحه للتو.

وأخيراً، قم بقياس الكثافة الضوئية للعينات باستخدام مقياس الطيف الضوئي ذو 96 بئراً عند طول موجي 570 nanometer دون استخدام مرشح مرجعي، وأدخل النتائج في جدول بيانات لحساب حيوية الأنسجة المقابلة. قم بإجراء التصحيحات الناتجة عن تداخل المواد الكيميائية المختبرة كما هو موضح في البروتوكول النصي هنا؛ وتظهر في هذه التجربة نتائج نموذجية لاختبار تهيج العين التي أُجريت على 10 مواد اختبار مع ضوابط سلبية وإيجابية. وقد لوحظ أن متوسط الكثافة الضوئية للضابط السلبي بلغ 1.31، وهو ما يقابل حيوية أنسجة بنسبة 100%، بينما بلغت الحيوية النسبية للأنسجة 31.2% بالنسبة للضابط الإيجابي. وأظهرت مواد الاختبار 1 و2 و4 و7 و8 حيوية أنسجة تزيد عن 60%، مما يصنف هذه المواد على أنها غير مهيجة، بينما كانت مواد الاختبار 3 و5 و6 و9 و10 مهيجة.

من ناحية أخرى، أظهرت الأنسجة تباينات في الحيوية بنسبة أقل من أو تساوي 60%، مما أدى إلى تصنيفها كمهيجات. وكان الفرق في حيوية الأنسجة بين العينات المكررة في هذه التجربة أقل من 20% لجميع المواد المختبرة باستثناء المادة المختبرة الثانية. وبناءً على ذلك، اعتبرت نتائج جميع المواد المختبرة، باستثناء المادة المختبرة الثانية، مؤهلة لأنها استوفت جميع معايير قبول اختبار تهيج العين.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء اختبار DICATION، باستخدام النموذج الرابع للأنسجة البشرية القرنية المعاد بناؤها في المختبر، لتحديد وتصنيف مخاطر المواد الكيميائية. وقد تم تطبيق هذا الإجراء في المبادئ التوجيهية لاختبار EOC D كجزء من استراتيجية الاختبار المتدرجة.