والطريقة الأمثل لعزل وتوسيع قسما ثابتا الطبيعية الخلايا التائية القاتلة من الماوس الطحال

الهدف العام من هذا الإجراء هو التوسع في خلايا T أو INKT القاتلة الطبيعية المتغيرة التي يتم حصادها من طحال الفأر. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الخلايا أحادية النواة الطحالية أولا ، متبوعا بتخصيب الخلايا الليمفاوية الخمسة الإيجابية عن طريق فصل الخلايا المغناطيسية. ثم يتم عزل جزء خلية INKT الطحالية عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة.

في الخطوة الأخيرة ، يتم وضع خلايا INKT التي تم فرزها للتوسع في المختبر. في النهاية ، يمكن تقييم ملف تعريف السيتوكين لخلايا INKT الموسعة بواسطة إليزا. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن تنقية خلايا INKT وتوسيعها يتطلب مزيجا من التقنيات المختلفة التي تؤديها.

سيتم شذب هذا الإجراء طالب دراسات عليا من مختبري. بعد حصاد الطحال ، انقل الأنسجة إلى مرشح نايلون 70 ميكرون ، ثم استخدم مكبس حقنة سعة ملليلتر لهرس الطحال برفق عبر المصفاة في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر وغسل الفلتر بخمسة ملليلتر من PBS. ثم أضف ثلاثة ملليلتر من عبوة الفحم إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وقم بتراكب تدرج الكثافة بخمسة ملليلتر من التعليق الخلوي.

افصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي وانقل الواجهة إلى أنبوب جديد سعة 15 مل. ثم اغسل الخلايا في 10 ملليلتر من PBS البارد وأعد تعليق الحبيبات في ملليلترين من المخزن المؤقت للفاكس لإثراء خمسة خلايا ليمفاوية طحالية إيجابية للقرص المضغوط. اضبط تخفيف الخلية إلى واحد في 10 إلى الخلايا السابعة لكل 90 ميكرولتر مع المزيد من المخزن المؤقت للفاكس وأضف 10 ميكرولتر من خمسة ميكروبيدات مضادة للقرص المضغوط إلى الخلايا.

بعد 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، اغسل الخلايا بأربعة ملليلتر من مخزن الفاكس المؤقت وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من مخزن الفاكس الجديد. اعزل القرص المضغوط خمس خلايا موجبة عن طريق فصل الخلايا المغناطيسية وفقا لتوصية الشركة المصنعة. ثم قم بتخفيف الخلايا الليمفاوية الموجبة المضغوطة المخصبة في وقت واحد 10 إلى الخلايا الست لكل 20 ميكرولتر عازلة inax تحتوي على مضاد CD 16 و CD 32 و PE المترافق ألفا غالس الهواء CD 1D tetramer في درجة حرارة الغرفة في الظلام بعد 30 دقيقة ، واحتضان الخلايا بالأجسام المضادة ذات الأهمية عند أربع درجات مئوية في الظلام لمدة 30 دقيقة أخرى.

ثم اغسل الخلايا في مخزن فاكس جديد وصطخها ب 10 ميكرولتر من محلول عمل 20 ميكرومولار من DPI لكل مرة واحدة في 10 إلى الخلايا الست لمدة خمس دقائق. في درجة حرارة الغرفة الآن ، اكتساب ما يقرب من واحد في 10 إلى القرص المضغوط المخصب الرابع خمسة أحداث للخلايا الليمفاوية الإيجابية على مقياس التدفق الخلوي ، البوابات إلكترونيا على التشتت الأمامي مع خلايا منخفضة لاستبعاد مزدوجات الخلية والمجاميع إلكترونيا. قم بإخراج القرص المضغوط الإيجابي DAPI ثماني خلايا موجبة CD 19 داخل الانتثار الأمامي مع عدد قليل من السكان واستخدم مخططات منطقة التشتت الجانبي والمبعثر الأمامي.

لتحديد الخلايا الليمفاوية إلكترونيا ، قم برسم tetramers ألفا غال SER CD 1D بواسطة CD Three epsilon وإلكترونيا ga ألفا غال سير CD 1D رباعي القرص المضغوط الإيجابي ثلاث خلايا INKT إيجابية إبسيلون كما هو موضح. ثم الحصول على ما لا يزيد عن ضعفين 10 إلى القرص المضغوط الخامس ، تحدد خمس خلايا ليمفاوية موجبة النسبة المئوية لآلفا غال SER CD 1D رباعي القرص المضغوط الإيجابي ثلاث خلايا INKT إيجابية إبسيلون الموجودة في الجزء الخلوي المخصب. باستخدام هذا النوع المنخفض من البوابة, ألفا ألسر CD 1D رباعي إيجابية CD ثلاثة خلايا INKT إيجابية إبسيلون في أنبوب فاكس يحتوي على ملليلتر واحد من مصل ربلة الساق الجنينية في نهاية الفرز.

اشطف خلايا NKT المعزولة من جانب أنبوب الفاكس ب 10 ملليلتر من وسط RPMI 1640. ثم قم بتدوير الخلايا ، وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من RPMI 1640 واستخدم 40 ميكرولتر من الخلايا لتقييم نقاء الخلايا التي تم فرزها. باستخدام نفس استراتيجية البوابات.

بالنسبة لإعداد معلمات الفرز لتوسيع خلايا INKT ، قم بتدوير الخلايا وإعادة تعليق الخلايا المعزولة بخمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر في وسط RPMI 1640 الكامل المكمل ب IL اثنين IL 12 ، ومضاد للقرص المضغوط 28. ثم قم بزرع الخلايا مرة واحدة من 10 إلى خلايا INKT الخامسة لكل بئر في 96 صفيحة مطلية بثلاثة إبسيلون ذات قاع مسطح ومضاد للقرص المضغوط واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا. بعد يومين ، انقل الخلايا إلى صفيحة بئر 96 مسطحة جديدة غير مطلية للاستزراع في ظروف الراحة في RPMI 1640 الكامل.

متوسط لمدة يومين آخرين. في اليوم الرابع بعد الفرز ، قم بعمل الماصة الطافية برفق في كل بئر لإخراج الخلايا وتجميعها في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الحنك بخمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر.

في وسط RPMI 16 الكامل مكمل ب IL سبعة وبذرة واحدة في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر. في صفيحة بئر جديدة مسطحة القاع 96 ، أعد الخلايا إلى الحاضنة بعد أربعة أيام ، واسحبها في أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مليلتر للطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في وسط RPMI 1640 كامل يحتوي على مضاد للذوبان CD 28 وزرع الخلايا على صفيحة قاع مسطحة 96 بئر مطلية بمضاد للقرص المضغوط ثلاثة إبسيلون في مرة واحدة 10 من الخلايا الخامسة لكل بئر وإعادة الخلايا إلى الحاضنة لمدة ثلاثة أيام أخرى ، أربعة أيام ، من 11 إلى 18.

كرر IL سبعة مضاد للقرص المضغوط 28 ومكافحة القرص المضغوط ثلاثة علاج إبسيلون كما هو موضح للتو في اليوم 19. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 ملليلترا. قم بتدويرها وإعادة تعليق الحبيبات بخمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر في RPMI 1640.Medium كامل.

ثم قم بزرع الخلايا مرة واحدة من 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر في صفيحة بئر 96 مسطحة القاع واسمح للخلايا بالراحة لمدة يومين في حاضنة زراعة الخلايا. يؤدي تحفيز خلايا INKT المصنفة مع اللوحة المضادة للقرص المضغوط ثلاثة إبسيلون في وجود IL two IL 12 ومضاد CD 28 القابل للذوبان إلى توسع ثلاثة أضعاف تقريبا لأرقام INKT بعد يومين من الاستزراع. يؤدي التوسع اللاحق لخلايا INKT في وجود IL سبعة إلى زيادة ثلاثة إلى أربعة أضعاف في عدد خلايا INKT الموجودة في اليوم الرابع في المزرعة.

يمكن أن يؤدي تكرار ظروف الثقافة هذه إلى ما معدله سبعة أضعاف 10 إلى خلايا INKT السابعة بعد جولتين من التمدد دون أي فقدان مرئي للخلايا بين التغييرات في وسائط الثقافة في أيام مختلفة ، مما يؤدي إلى توسع لا يقل عن 70 ضعفا في 18 يوما. تم تنشيط خلايا INKT الموسعة مع المورين المؤتلف المرتبط بالصفيحة. ينتج CD 1D المحمل بألفا ألسر IL اثنين من IL أربعة IFN gamma و TNF alpha و IL ستة في 48 ساعة بعد التحفيز ، مما يدل على أن خلايا INKT تحتفظ بقدرتها على إنتاج TH واحد و TH اثنين من السيتوكينات بعد التمدد.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن التلوين المناسب لخلايا INKT باستخدام cdre المحمل بسيراميد ألفا ضروري لتحديد خلايا INKT أثناء قياس التدفق الخلوي. واثق.