وإنتاجية عالية منصة ميكروأري الخليوي لتحليل مترابط من تمايز الخلايا وقوات الجر
March 1st, 2017
وينظم تمايز الخلايا من قبل مجموعة من العوامل microenvironmental، بما في ذلك تكوين مصفوفة والمواد الركيزة خصائص. نحن هنا وصف تقنية استخدام ميكروأرس خلية بالتعاون مع قوة الجر المجهري لتقييم كلا تمايز الخلايا والنشاط الحيوي التفاعلات خلية الركيزة بوصفها وظيفة من السياق microenvironmental.
الهدف العام لمنصة المصفوفات الدقيقة للخلية هو ربط قياسات كل من تمايز الخلايا وقوى الجر كدالة للسياق البيئي الجزئي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال هندسة الأنسجة مما يتيح التحقيقات الأساسية لبيولوجيا الخلايا الجذعية وتحسين بروتوكولات التمايز. تشمل المزايا الرئيسية لهذه التقنية إنتاجيتها ، وقدرتها على تغيير الإشارات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية ، وقراءات نقطة النهاية بواسطة كل من الفلور المناعي والفحص المجهري لقوة الجر ، أو TFM.
على الرغم من استخدام هذه الطريقة, أولئك الذين يفهمون تمايز سلف الكبد يمكن تطبيقها بسهولة على أنواع الخلايا الشريانية الأخرى وسياقات الأنسجة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث يعتمد النجاح التجريبي على تكامل بروتوكول المصفوفة مع كل من ركائز الهيدروجيل عالية الجودة والفحص المجهري لقوة الجر. لتصنيع حبة الفلورسنت التي تحتوي على هيدروجيل بولي أكريلاميد على طبق بتري زجاجي 35 مم من السيلان للتقييم المباشر لتفاعلات الركيزة الخلية باستخدام TFM ، أولا ، قم بإعداد ركائز زجاجية في محاليل كما هو موضح في بروتوكول النص.
ضع أطباق بتري ذات قاع زجاجي مقاس 35 مم في صينية تجفيف زجاجية وماصة 20 ميكرولترا من حبة البوليمر المسبقة من 9 إلى 1 لمحلول بادئ الصور في وسط كل طبق. قم بتغطية كل طبق برفق بزلة غطاء دائرية مقاس 12 مم مع تجنب تكوين الفقاعات. من أجل توزيع حبات الفلورسنت على سطح الهيدروجيل ، اقلب الأطباق واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
بينما لا يزال مقلوبا ، قم بتعريض الطبق للأشعة فوق البنفسجية 365 نانومتر لمدة 10 دقائق. تحسين وقت البلمرة حسب الحاجة. بعد ذلك ، اغمر الهلاميات المائية في 1 مولي HEPES واتركها في درجة حرارة الغرفة في الظلام طوال الليل.
قم بإزالة زلات الغطاء بعناية باستخدام ماكينة حلاقة ، مع الحرص على عدم إتلاف الهلاميات المبلمرة المبلمرة. جفف الهلاميات المائية على حرارة 50 درجة مئوية على طبق ساخن حتى تجف. يمكن تخزين الهلاميات المائية في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ثلاثة أشهر.
قم بإعداد المخازن المؤقتة لطباعة الجزيئات الحيوية وللوحة المصدر كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد تحميل المسامير النظيفة كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بإعداد المصفوفة الدقيقة وبرمجتها باستخدام برنامج الشركة المصنعة. بعد ذلك ، قم بتشغيل وحدة المرطب.
اضبط نقطة الضبط على 65٪ رطوبة نسبية وانتظر حتى يتطابق مقياس الريومتر مع نقطة الضبط. ضع لوحة المصدر في المحول المناسب. ثم ضع ركائز الهيدروجيل المجففة في المحول المناسب.
اضبط معلمات البرنامج لتعكس بدقة تخطيط لوحة المصدر وتصميم المصفوفة والتنسيق المطلوب. ابدأ تصنيع المصفوفة. تحقق من ما لا يقل عن مرة واحدة في الساعة من أن الرطوبة لم تنخفض عن 65٪ من الرطوبة النسبية وأن المسامير غير مسدودة.
إذا انخفضت الرطوبة بشكل غير متوقع ، فقم بإيقاف المصفوفة مؤقتا لملء جهاز الترطيب ومسح أنابيب التكثيف المرتبطة بها. إذا كانت المسامير مسدودة، فقم بإيقاف المصفوفة مؤقتا لتنظيف المسامير أو استبدالها بدبابيس تم تنظيفها مسبقا. بمجرد اكتمال البرنامج ، ضع المصفوفات المصنعة في صندوق منزلق أو لوحة صغيرة مغطاة بورق الألمنيوم.
اترك المصفوفات في درجة حرارة الغرفة عند 65٪ رطوبة نسبية طوال الليل. في تجربتنا ، ترتبط الصعوبات الأكثر شيوعا بتصنيع المصفوفة. نوصي بتأكيد الجودة التقنية والمتانة للمصفوفات المصنعة باستخدام جزيئات مصنفة بشكل فلوريسنت، وبقع البروتين العامة، والمواد المناعية.
في اليوم التالي للتصنيع ، اغمر أطباق بتري مقاس 35 مم في 3 مل من حجم 1٪ لكل حجم البنسلين والستربتومايسين في PVS. كشف الركائز المصفوفة في الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة. ثم استبدل محلول البنسلين والستربتومايسين بوسط زراعة الخلايا.
بعد جمع الخلايا وعدها ، قم بزرع الخلايا على مصفوفات بمعدل 3 مل لكل طبق بتري 35 مم. احتضان مزارع المصفوفة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة ساعتين إلى 24 ساعة ، أو حتى تكوين جزر خلوية مأهولة بالسكان. يمكن تعديل كثافة البذر والوقت اعتمادا على الخلايا والتطبيق المحدد.
بعد السماح بتكوين جزر الخلايا ، اغسل مزارع المصفوفة مرتين ب 3 مل من وسائط زراعة الخلايا الدافئة مسبقا. في هذه المرحلة ، يمكن إضافة الضوابط والمعالجات المناسبة ذات الأهمية إلى النظام البيولوجي. قم بتغيير وسائط المصفوفات كل يوم إلى يومين للحفاظ على تركيز أي علاجات.
في غضون يوم إلى خمسة أيام من بدء مزارع المصفوفة ، قم بإجراء تقييم مباشر لتفاعلات ركيزة الخلية باستخدام TFM. انقل أطباق بتري مقاس 35 مم التي تحتوي على مزارع مصفوفة إلى مجهر فلوري مقلوب محتضن مع مرحلة روبوتية لقياسات TFM. في طبق واحد ، حدد المواضع ومستويات التركيز لجزر الخلايا الفردية باستخدام الفحص المجهري لتباين الطور.
قم بالتبديل إلى الفحص المجهري الفلوري الأحمر البعيد لتصور الخرز. ثم ارجع إلى كل موضع من المواضع المحفوظة في الخطوة السابقة وقم بتصحيح الإحداثيات z لمستوى التركيز البؤري ، بحيث تكون الطبقة الأولى فقط من الخرز أسفل جزيرة الخلية في بؤرة التركيز. احفظ الإحداثيات الجديدة وانتقل إلى التصوير الآلي لجميع جزر الخلايا لالتقاط تباين مرحلة ما قبل التفكك وصور الفلورسنت الحمراء البعيدة.
بعد ذلك ، أضف بعناية 150 ميكرولترا من محلول BSA / SDS إلى الطبق وانتظر خمس دقائق للسماح بالانفصال الكامل للخلية عن الركيزة. مراقبة تفكك الخلايا باستخدام الفحص المجهري لتباين الطور. بعد فصل جزر الخلية عن الركيزة ، ارجع إلى المواضع المحددة وتحقق من أن الطبقة الأولى من الخرز لا تزال في بؤرة التركيز.
إذا كانت هذه الخرزات خارج المستوى بسبب التشوه الناجم عن الجر الناتج عن الخلايا ، فقم بتصحيح إحداثيات z للمستوى المركز بحيث يتم التركيز عليها مرة أخرى. احفظ إحداثيات z المصححة وكرر التصوير الآلي لجميع الجزر لالتقاط صور الفلورسنت الحمراء البعيدة بعد التفكك. كرر هذه الخطوات للأطباق المتبقية.
روابطالشق المترافقة بالبروتين A / G خشنة واحدة وأظهرت دلتا مثل واحدة تحسنا في الاحتفاظ بالهيدروجيل. أدى عرض الترابط الشق أيضا إلى تمايز أسلاف الكبد نحو مصير خلية القناة الصفراوية كما يتضح من وجود علامة خلية القناة الصفراوية الخضراء. تم تحديد الاستجابة لروابط الشق لخمسة بروتينات مصفوفة خارج الخلية ، أو ECM ، وأظهرت أن استجابة أسلاف الكبد للروابط تعتمد على سياق ECM.
تم استخدام ضربة قاضية صغيرة في الحمض النووي الريبي لتوليد أسلاف بدون دلتا الروابط مثل واحدة وخشنة. ثم تم تقديم الخلايا مع روابط الشق خشنة واحدة ودلتا مثل واحدة ودلتا مثل أربعة. اختلفت الاستجابة لترابط الشق المصفوف اعتمادا على التعبير الجوهري الخلوي لأي من الترابط.
تظهر هذه الصور تمايز أسلاف الكبد على حد سواء صلابة الركيزة وتكوين ECM. كشف التحليل الكمي أن الكولاجين الرابع يدعم التمايز على كل من الركائز الناعمة والصلبة ، بينما يدعم الفيبرونيكتين فقط التمايز على الركائز الصلبة. تشير خرائط الحرارة التمثيلية إلى أن إجهاد الجر المستمر عند صلابة الركيزة المنخفضة على الكولاجين الرابع يعزز التمايز إلى خلايا القناة الصفراوية.
تم تأكيد هذه النتيجة من خلال القياس الكمي لمتوسط القيم التربيعية الجذرية لإجهاد الجر. قدم هذا الفيديو والبروتوكول المصاحب الخطوات الرئيسية لتصنيع الهلاميات المائية والمصفوفات لإجراء زراعة الخلايا على الركائز المصفوفة ولقياس تفاعلات الركيزة الخلوية باستخدام الفحص المجهري لقوة الجر. بعد التعرف على التقنيات ، يمكن إكمال كل تجربة في أقل من أسبوع إلى أسبوعين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.
في الانكماش مع هذه الطريقة ، يجب استخدام مزارع الخلايا للتحقق من صحة ظروف المصفوفة عالية الدرجات باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل النوعي ، أو النشاف المناعي ، أو محاور البيولوجيا الميكانيكية ذات المقياس القياسي أو تقنيات البيولوجيا الجزيئية التكميلية الأخرى. يمكن تطبيق هذه المنصة متعددة الاستخدامات من أجل التحقيق في الإنتاجية العالية لوظائف الخلية في عدد كبير من سياقات الخلايا والأنسجة ، بما في ذلك تمايز الخلايا الجذعية وبيولوجيا الخلايا السرطانية.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة منصة مصفوفة خلوية مصممة لربط تمايز الخلايا وقوى الجر في سياقات مختلفة من البيئة المجهرية. تعزز هذه الطريقة فهم بيولوجيا الخلايا الجذعية وتطبيقات هندسة الأنسجة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلية
- هندسة الأنسجة
- الميكانيكا الحيوية
الخلفية
- يتأثر تمايز الخلايا بالعوامل البيئية المجهرية.
- يتم استخدام ميكروسكوب قوى الجر (TFM) لتقييم تفاعلات الخلية- الركيزة.
- تعتبر التقنيات عالية الإنتاجية ضرورية لتقدم أبحاث الخلايا الجذعية.
- دمج الإشارات البيوكيميائية والبيوفية أمر حاسم لنجاح التجربة.
هدف الدراسة
- لتقييم تمايز الخلايا والتفاعلات الميكانيكية الحيوية.
- لتحسين بروتوكولات التمايز لأنواع مختلفة من الخلايا.
- لتقديم توضيح مرئي لتقنية المصفوفة المجهرية.
الطرق المستخدمة
- تصنيع هياكل هلامية من البولي أكريلاميد مع حبات فلورية.
- طباعة مصفوفات من الجزيئات الحيوية.
- زراعة الخلايا وبذرها على المصفوفات المصنّعة.
- التقييم المباشر لتفاعلات الخلية- الركيزة باستخدام TFM.
النتائج الرئيسية
- تسمح هذه الطريقة بمراقبة سلوك الخلايا في الوقت الفعلي.
- تم إثبات التمايز الناجح لخلايا سلف الكبد.
- يمكن تصنيع مصفوفات عالية الجودة بنتائج متسقة.
- يوفر TFM رؤى حول الخصائص الميكانيكية لتفاعلات الخلايا.
الاستنتاجات
- تعتبر منصة المصفوفة المجهرية للخلايا أداة قيمة لأبحاث الخلايا الجذعية.
- تمكن من دراسة أنواع مختلفة من الخلايا وتمايزها.
- قد تمتد التطبيقات المستقبلية إلى سياقات نسيجية أخرى.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This platform enables high-throughput correlation of biochemical and biophysical cues in stem cell differentiation, addressing a key challenge in tissue engineering and regenerative medicine. By integrating immunofluorescence and traction force microscopy, it provides quantitative, multiparametric readouts that enhance predictive confidence in early target validation and mechanistic de-risking. The system supports scalable screening of microenvironmental factors, informing go/no-go decisions in preclinical pipeline advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating differentiation outcomes with subcellular traction forces under defined microenvironmental conditions.
- Operational Value: Supports functional target validation through high-throughput screening of ECM proteins and ligand combinations in a controlled, reproducible format.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by identifying how substrate stiffness and biochemical cues jointly influence cell fate decisions, reducing ambiguity in target mechanism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative datasets on cell differentiation and traction forces, enabling reliable compound or ligand evaluation across arrayed conditions.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through standardized hydrogel fabrication, controlled humidity during printing, and validated bead-based TFM readouts.
- Scalability Value: Compatible with microarray printing workflows, allowing parallel testing of dozens of microenvironmental combinations per slide for efficient lead identification.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Demonstrates disease-relevant applicability in liver progenitor differentiation, with direct readouts of bile duct cell fate via immunofluorescence and biomechanical metrics.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery-scale mechanistic insights with preclinical validation by providing multiparametric data on differentiation efficacy and mechanobiological responses.
- Risk-Adjusted Decision-Making: Enables prioritization of conditions that show sustained traction stress and differentiation on permissive matrices, supporting data-driven advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, particularly for targets where mechanotransduction influences efficacy or toxicity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating the effects of arrayed biochemical and biophysical variables on cell differentiation and force generation.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized outputs via immunofluorescence and TFM, enabling quantitative comparison of microenvironmental conditions.
- Analytics: Provides multiparametric readouts (fluorescence intensity, traction stress RMS) that allow teams to rank conditions by differentiation efficacy and mechanical phenotype.
- Translational Research: Connects to preclinical work through validated, disease-relevant cell models and measurable biomechanical endpoints predictive of tissue-level behavior.
- Enterprise Reuse: Fabricated hydrogel substrates are storable and reusable across projects, positioning the platform as a scalable, cross-disciplinary capability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target mechanisms by reducing mechanistic ambiguity through correlated biochemical and biomechanical profiling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via controlled hydrogel fabrication, environmental monitoring during arraying, and validated dissociation/re-imaging workflows for TFM.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid triage of microenvironmental conditions, reducing reliance on low-throughput, sequential validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying conditions with concordant differentiation and biomechanical responses, informing advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel chemistry, microarray printing, and traction force microscopy setup and calibration.
- Dependent on access to UVA/UVC exposure systems, humidified arraying platforms, and inverted fluorescent microscopes with robotic stages.
- Necessitates cross-team standardization of array fabrication protocols, including humidity control, pin maintenance, and substrate storage conditions.
- Adaptation to alternative cell types may require optimization of seeding density, culture duration, and dissociation conditions.
- Practical limitations include the need for careful bubble avoidance during hydrogel polymerization and validation of array quality via fluorescent labeling prior to cell culture.
