وإنتاجية عالية منصة ميكروأري الخليوي لتحليل مترابط من تمايز الخلايا وقوات الجر

يكمن الهدف العام لمنصة المصفوفة الدقيقة للخلايا هذه في ربط قياسات كل من تمايز الخلايا وقوى الشد كدالة للسياق البيئي الدقيق. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال هندسة الأنسجة، مما يتيح إجراء أبحاث أساسية في بيولوجيا الخلايا الجذعية وتحسين بروتوكولات التمايز. وتشمل المزايا الرئيسية لهذه التقنية إنتاجيتها العالية، والقدرة على تغيير الإشارات الكيميائية الحيوية والبيوفيزيائية، وقراءات النقاط النهائية باستخدام كل من التألق المناعي ومجهر قوة الشد، أو TFM.

على الرغم من استخدام هذه الطريقة لفهم تمايز سلائف الكبد، إلا أنه يمكن تطبيقها بسهولة على أنواع أخرى من الخلايا الشريانية وسياقات نسيجية مختلفة. ويُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث يعتمد النجاح التجريبي على دمج بروتوكول الترتيب مع كل من ركائز الهيدروجيل عالية الجودة ومجهر قوة السحب. لتصنيع هيدروجيلات البولي أكريلاميد التي تحتوي على حبيبات فلورية على طبق بتري زجاجي القاعدة بقطر 35 مم ومعالج بالسيليل لتقييم تفاعلات الخلايا مع الركيزة بشكل حي باستخدام TFM، قم أولاً بتجهيز الركائز الزجاجية في المحاليل كما هو موضح في البروتوكول النصي.

ضع أطباق بتري ذات القاع الزجاجي المعالجة بالسيلان والمقاس 35 mm في صينية تجفيف زجاجية، ثم انقل بواسطة الماصة 20 µL من محلول خرز البوليمر الأولي والمبادئ الضوئية بنسبة 9 إلى 1 إلى مركز كل طبق. غطِّ كل طبق برفق باستخدام غطاء شريحة دائري مقاس 12 mm مع تجنب تكوين فقاعات. ومن أجل توزيع الخرز الفلوري على سطح الهيدروجيل، اقلب الأطباق واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

وبينما لا يزال الطبق مقلوباً، قم بتعريضه للأشعة فوق البنفسجية UVA بطول موجي 365 نانومتر لمدة 10 دقائق. قم بتحسين وقت البلمرة حسب الحاجة. بعد ذلك، اغمر الهيدروجيلات في محلول HEPES المنظم بتركيز 1 مولار واتركها في درجة حرارة الغرفة في الظلام طوال الليل.

قم بإزالة شرائح الغطاء بعناية باستخدام شفرة حلاقة، مع الحرص على عدم إتلاف الهيدروجيلات المبلمرة. قم بتجفيف الهيدروجيلات عند 50 درجة Celsius على لوح تسخين حتى تجف. يمكن تخزين الهيدروجيلات في درجة حرارة الغرفة في مكان مظلم لمدة ثلاثة أشهر.

قم بتحضير المحاليل المنظمة لطباعة الجزيئات الحيوية ولصفيحة المصدر وفقاً لما هو موضح في البروتوكول المكتوب. بعد تحميل الدبابيس النظيفة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب، قم بتجهيز جهاز المصفوفات الدقيقة وبرمجته باستخدام برنامج الشركة المصنعة. بعد ذلك، قم بتشغيل وحدة ترطيب الجو.

اضبط نقطة الضبط على 65% من الرطوبة النسبية وانتظر حتى يتطابق المقياس الريومي مع نقطة الضبط. ضع لوحة المصدر في المهايئ المناسب. ثم ضع ركائز الهيدروجيل المجففة في المهايئ المناسب.

قم بضبط معلمات البرنامج لتعكس بدقة مخطط الطبق المصدر، وتصميم المصفوفة، والتنسيق المطلوب. ابدأ عملية تصنيع المصفوفة. تحقق، بمعدل لا يقل عن مرة واحدة كل ساعة، من أن الرطوبة لم تنخفض عن 65% رطوبة نسبية وأن الدبابيس ليست مسدودة.

إذا انخفضت الرطوبة بشكل غير متوقع، أوقف عملية ترتيب المصفوفات مؤقتاً لملء المرطب وتفريغ الأنابيب المرتبطة من التكثيف. وإذا كانت الدبابيس مسدودة، أوقف عملية الترتيب مؤقتاً لتنظيف الدبابيس أو استبدالها بدبابيس منظفة مسبقاً. وبمجرد اكتمال البرنامج، ضع المصفوفات المصنعة في صندوق شرائح أو طبق ميكروي مغطى بورق ألومنيوم.

اترك المصفوفات في درجة حرارة الغرفة وعند رطوبة نسبية تبلغ 65% طوال الليل. وبناءً على خبرتنا، فإن أكثر الصعوبات شيوعاً تتعلق بتصنيع المصفوفات. لذا نوصي بالتأكد من الجودة التقنية ومتانة المصفوفات المصنعة باستخدام جزيئات مُوسومة فلورياً، وأصباغ البروتين العامة، والتقنيات المناعية الفلورية.

في اليوم التالي لعملية التصنيع، اغمر أطباق بتري ذات قطر 35 مم التي تحتوي على المصفوفة في 3 mL من بنسيلين-ستربتومايسين بتركيز 1% حجم/حجم في PVS. عرّض الركائز المصفوفة للأشعة فوق البنفسجية UVC لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، استبدل محلول البنسيلين-ستربتومايسين بوسط زراعة الخلايا.

بعد جمع الخلايا وعدّها، قم بتوزيع الخلايا على المصفوفات بمعدل 3 mL لكل طبق بتري مقاس 35 mm. حضّن مزارع المصفوفة عند 37 درجة مئوية و5%CO2 لمدة تتراوح بين ساعتين إلى 24 ساعة، أو حتى تتشكل جزر خلوية مأهولة جيداً. يمكن تعديل كثافة التوزيع والوقت بناءً على نوع الخلايا والتطبيق المحدد.

بعد السماح بتكوين جزر خلوية، اغسل مزارع المصفوفة مرتين باستخدام 3 mL من وسط زراعة الخلايا المدفأ مسبقاً. وفي هذه المرحلة، يمكن إضافة الضوابط المناسبة والمعالجات المراد دراستها إلى النظام البيولوجي. قم بتغيير أوساط المصفوفات كل يوم إلى يومين للحفاظ على تركيز أي من المعالجات.

خلال فترة تتراوح من يوم واحد إلى خمسة أيام من بدء زراعة المصفوفات، قم بإجراء تقييم حي للتفاعلات بين الخلايا والركيزة باستخدام TFM. انقل أطباق بيتري ذات قطر 35 mm التي تحتوي على زراعات المصفوفات إلى مجهر فلوري مقلوب مُحضن ومزود بمنصة روبوتية لإجراء قياسات TFM. في طبق واحد، حدد مواقع ومستويات تركيز جزر خلوية فردية باستخدام مجهر تباين الطور.

انتقل إلى المجهر الفلوري بالأشعة الحمراء البعيدة لرؤية الخرزات. ثم عُد إلى كل موضع من المواضع المحفوظة في الخطوة السابقة وقم بتصحيح الإحداثي z لمستوى التركيز، بحيث تكون الطبقة الأولى فقط من الخرزات الموجودة أسفل جزيرة الخلايا في بؤرة التركيز. احفظ الإحداثيات الجديدة وانتقل إلى التصوير الآلي لجميع جزر الخلايا لالتقاط صور تباين الطور والصور الفلورية بالأشعة الحمراء البعيدة في مرحلة ما قبل التفكيك.

بعد ذلك، أضف بعناية 150 µL من محلول BSA/SDS إلى الطبق وانتظر خمس دقائق للسماح بالتفكك الكامل للخلايا عن الركيزة. راقب تفكك الخلايا باستخدام مجهر تباين الأطوار. بعد تفكك الجزر الخلوية عن الركيزة، عُد إلى المواضع المحددة وتحقق من أن الطبقة الأولى من الخرز لا تزال في بؤرة التركيز.

إذا كانت هذه الخرزات خارج المستوى بسبب التشوه الناتج عن قوة السحب التي تولدها الخلية، فقم بتصحيح إحداثي z للمستوى البؤري حتى تصبح في التركيز مرة أخرى. احفظ إحداثيات z المصححة وكرر التصوير الآلي لجميع الجزر لالتقاط الصور الفلورية ذات اللون الأحمر البعيد بعد التفكك. كرر هذه الخطوات للأطباق المتبقية.

أظهرت ربيطات Notch (jagged one و delta like one) المقترنة ببروتين A/G تحسناً في الاستبقاء داخل الهيدروجيلات. كما أدى تقديم ربيطة Notch إلى تحفيز تمايز سلائف الكبد نحو مصير خلايا القناة الصفراوية، وهو ما أشارت إليه وجود العلامة الخضراء المميزة لخلايا القناة الصفراوية. وقد تم قياس الاستجابة لربيطات Notch لخمسة من بروتينات المصفوفة خارج الخلوية (ECM)، وأظهرت النتائج أن استجابة سلائف الكبد للربيطات تعتمد على سياق المصفوفة خارج الخلوية.

استُخدم إسكات الجينات بواسطة الحمض النووي الريبي قصير تلاحمي الشعر (shRNA) لتوليد خلايا سلفية تفتقر إلى الربيطات delta like one وjagged one. بعد ذلك، عُرّضت الخلايا لربيطات notch وهي jagged one وdelta like one وdelta like four. وقد تباينت الاستجابة لربيطة notch المنسقة بناءً على التعبير الذاتي للخلية عن أي من هذه الربيطات.

تظهر هذه الصور أن تمايز سلائف الكبد يعتمد على كل من صلابة الركيزة وتكوين المصفوفة خارج الخلوية (ECM). وقد كشف التحليل الكمي أن الكولاجين الرابع يدعم التمايز على كل من الركائز الرخوة والصلبة، بينما يدعم الفيبرونيكتين التمايز على الركائز الصلبة فقط. وتشير الخرائط الحرارية التمثيلية إلى أن إجهاد السحب المستمر عند صلابة ركيزة منخفضة على الكولاجين الرابع يعزز التمايز إلى خلايا القناة الصفراوية.

تم تأكيد هذه النتيجة من خلال قياس القيم المتوسطة لجذر متوسط المربعات لإجهاد السحب. لقد قدم هذا الفيديو والبروتوكول المرفق به الخطوات الرئيسية لتصنيع الهيدروجيل والمصفوفات لإجراء زراعة الخلايا على الركائز المصفوفة، ولقياس التفاعلات بين الخلايا والركائز باستخدام مجهر قوة السحب. بعد الإلمام بهذه التقنيات، يمكن إتمام كل تجربة في غضون أسبوع إلى أسبوعين فقط إذا نُفذت بشكل صحيح.

بالتزامن مع هذه الطريقة، ينبغي استخدام المزارع الخلوية للتحقق من ظروف المصفوفة ذات الدرجات العالية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل النوعي (qualitative PCR)، أو اللطخة المناعية، أو محاور الميكانيكا الحيوية ذات المقياس القياسي، أو غيرها من تقنيات البيولوجيا الجزيئية التكميلية. ويمكن تطبيق هذه المنصة متعددة الاستخدامات في الاستقصاء عالي الإنتاجية لوظائف الخلايا في مجموعة واسعة من سياقات الخلايا والأنسجة، بما في ذلك تمايز الخلايا الجذعية وبيولوجيا الخلايا السرطانية.