وإنتاجية عالية منصة ميكروأري الخليوي لتحليل مترابط من تمايز الخلايا وقوات الجر

وينظم تمايز الخلايا من قبل مجموعة من العوامل microenvironmental، بما في ذلك تكوين مصفوفة والمواد الركيزة خصائص. نحن هنا وصف تقنية استخدام ميكروأرس خلية بالتعاون مع قوة الجر المجهري لتقييم كلا تمايز الخلايا والنشاط الحيوي التفاعلات خلية الركيزة بوصفها وظيفة من السياق microenvironmental.

الهدف العام لمنصة المصفوفات الدقيقة للخلية هو ربط قياسات كل من تمايز الخلايا وقوى الجر كدالة للسياق البيئي الجزئي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال هندسة الأنسجة مما يتيح التحقيقات الأساسية لبيولوجيا الخلايا الجذعية وتحسين بروتوكولات التمايز. تشمل المزايا الرئيسية لهذه التقنية إنتاجيتها ، وقدرتها على تغيير الإشارات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية ، وقراءات نقطة النهاية بواسطة كل من الفلور المناعي والفحص المجهري لقوة الجر ، أو TFM.

على الرغم من استخدام هذه الطريقة, أولئك الذين يفهمون تمايز سلف الكبد يمكن تطبيقها بسهولة على أنواع الخلايا الشريانية الأخرى وسياقات الأنسجة. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث يعتمد النجاح التجريبي على تكامل بروتوكول المصفوفة مع كل من ركائز الهيدروجيل عالية الجودة والفحص المجهري لقوة الجر. لتصنيع حبة الفلورسنت التي تحتوي على هيدروجيل بولي أكريلاميد على طبق بتري زجاجي 35 مم من السيلان للتقييم المباشر لتفاعلات الركيزة الخلية باستخدام TFM ، أولا ، قم بإعداد ركائز زجاجية في محاليل كما هو موضح في بروتوكول النص.

ضع أطباق بتري ذات قاع زجاجي مقاس 35 مم في صينية تجفيف زجاجية وماصة 20 ميكرولترا من حبة البوليمر المسبقة من 9 إلى 1 لمحلول بادئ الصور في وسط كل طبق. قم بتغطية كل طبق برفق بزلة غطاء دائرية مقاس 12 مم مع تجنب تكوين الفقاعات. من أجل توزيع حبات الفلورسنت على سطح الهيدروجيل ، اقلب الأطباق واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

بينما لا يزال مقلوبا ، قم بتعريض الطبق للأشعة فوق البنفسجية 365 نانومتر لمدة 10 دقائق. تحسين وقت البلمرة حسب الحاجة. بعد ذلك ، اغمر الهلاميات المائية في 1 مولي HEPES واتركها في درجة حرارة الغرفة في الظلام طوال الليل.

قم بإزالة زلات الغطاء بعناية باستخدام ماكينة حلاقة ، مع الحرص على عدم إتلاف الهلاميات المبلمرة المبلمرة. جفف الهلاميات المائية على حرارة 50 درجة مئوية على طبق ساخن حتى تجف. يمكن تخزين الهلاميات المائية في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ثلاثة أشهر.

قم بإعداد المخازن المؤقتة لطباعة الجزيئات الحيوية وللوحة المصدر كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد تحميل المسامير النظيفة كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بإعداد المصفوفة الدقيقة وبرمجتها باستخدام برنامج الشركة المصنعة. بعد ذلك ، قم بتشغيل وحدة المرطب.

اضبط نقطة الضبط على 65٪ رطوبة نسبية وانتظر حتى يتطابق مقياس الريومتر مع نقطة الضبط. ضع لوحة المصدر في المحول المناسب. ثم ضع ركائز الهيدروجيل المجففة في المحول المناسب.

اضبط معلمات البرنامج لتعكس بدقة تخطيط لوحة المصدر وتصميم المصفوفة والتنسيق المطلوب. ابدأ تصنيع المصفوفة. تحقق من ما لا يقل عن مرة واحدة في الساعة من أن الرطوبة لم تنخفض عن 65٪ من الرطوبة النسبية وأن المسامير غير مسدودة.

إذا انخفضت الرطوبة بشكل غير متوقع ، فقم بإيقاف المصفوفة مؤقتا لملء جهاز الترطيب ومسح أنابيب التكثيف المرتبطة بها. إذا كانت المسامير مسدودة، فقم بإيقاف المصفوفة مؤقتا لتنظيف المسامير أو استبدالها بدبابيس تم تنظيفها مسبقا. بمجرد اكتمال البرنامج ، ضع المصفوفات المصنعة في صندوق منزلق أو لوحة صغيرة مغطاة بورق الألمنيوم.

اترك المصفوفات في درجة حرارة الغرفة عند 65٪ رطوبة نسبية طوال الليل. في تجربتنا ، ترتبط الصعوبات الأكثر شيوعا بتصنيع المصفوفة. نوصي بتأكيد الجودة التقنية والمتانة للمصفوفات المصنعة باستخدام جزيئات مصنفة بشكل فلوريسنت، وبقع البروتين العامة، والمواد المناعية.

في اليوم التالي للتصنيع ، اغمر أطباق بتري مقاس 35 مم في 3 مل من حجم 1٪ لكل حجم البنسلين والستربتومايسين في PVS. كشف الركائز المصفوفة في الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة. ثم استبدل محلول البنسلين والستربتومايسين بوسط زراعة الخلايا.

بعد جمع الخلايا وعدها ، قم بزرع الخلايا على مصفوفات بمعدل 3 مل لكل طبق بتري 35 مم. احتضان مزارع المصفوفة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة ساعتين إلى 24 ساعة ، أو حتى تكوين جزر خلوية مأهولة بالسكان. يمكن تعديل كثافة البذر والوقت اعتمادا على الخلايا والتطبيق المحدد.

بعد السماح بتكوين جزر الخلايا ، اغسل مزارع المصفوفة مرتين ب 3 مل من وسائط زراعة الخلايا الدافئة مسبقا. في هذه المرحلة ، يمكن إضافة الضوابط والمعالجات المناسبة ذات الأهمية إلى النظام البيولوجي. قم بتغيير وسائط المصفوفات كل يوم إلى يومين للحفاظ على تركيز أي علاجات.

في غضون يوم إلى خمسة أيام من بدء مزارع المصفوفة ، قم بإجراء تقييم مباشر لتفاعلات ركيزة الخلية باستخدام TFM. انقل أطباق بتري مقاس 35 مم التي تحتوي على مزارع مصفوفة إلى مجهر فلوري مقلوب محتضن مع مرحلة روبوتية لقياسات TFM. في طبق واحد ، حدد المواضع ومستويات التركيز لجزر الخلايا الفردية باستخدام الفحص المجهري لتباين الطور.

قم بالتبديل إلى الفحص المجهري الفلوري الأحمر البعيد لتصور الخرز. ثم ارجع إلى كل موضع من المواضع المحفوظة في الخطوة السابقة وقم بتصحيح الإحداثيات z لمستوى التركيز البؤري ، بحيث تكون الطبقة الأولى فقط من الخرز أسفل جزيرة الخلية في بؤرة التركيز. احفظ الإحداثيات الجديدة وانتقل إلى التصوير الآلي لجميع جزر الخلايا لالتقاط تباين مرحلة ما قبل التفكك وصور الفلورسنت الحمراء البعيدة.

بعد ذلك ، أضف بعناية 150 ميكرولترا من محلول BSA / SDS إلى الطبق وانتظر خمس دقائق للسماح بالانفصال الكامل للخلية عن الركيزة. مراقبة تفكك الخلايا باستخدام الفحص المجهري لتباين الطور. بعد فصل جزر الخلية عن الركيزة ، ارجع إلى المواضع المحددة وتحقق من أن الطبقة الأولى من الخرز لا تزال في بؤرة التركيز.

إذا كانت هذه الخرزات خارج المستوى بسبب التشوه الناجم عن الجر الناتج عن الخلايا ، فقم بتصحيح إحداثيات z للمستوى المركز بحيث يتم التركيز عليها مرة أخرى. احفظ إحداثيات z المصححة وكرر التصوير الآلي لجميع الجزر لالتقاط صور الفلورسنت الحمراء البعيدة بعد التفكك. كرر هذه الخطوات للأطباق المتبقية.

الشق المترافقة بالبروتين A / G خشنة واحدة وأظهرت دلتا مثل واحدة تحسنا في الاحتفاظ بالهيدروجيل. أدى عرض الترابط الشق أيضا إلى تمايز أسلاف الكبد نحو مصير خلية القناة الصفراوية كما يتضح من وجود علامة خلية القناة الصفراوية الخضراء. تم تحديد الاستجابة لروابط الشق لخمسة بروتينات مصفوفة خارج الخلية ، أو ECM ، وأظهرت أن استجابة أسلاف الكبد للروابط تعتمد على سياق ECM.

تم استخدام ضربة قاضية صغيرة في الحمض النووي الريبي لتوليد أسلاف بدون دلتا الروابط مثل واحدة وخشنة. ثم تم تقديم الخلايا مع روابط الشق خشنة واحدة ودلتا مثل واحدة ودلتا مثل أربعة. اختلفت الاستجابة لترابط الشق المصفوف اعتمادا على التعبير الجوهري الخلوي لأي من الترابط.

تظهر هذه الصور تمايز أسلاف الكبد على حد سواء صلابة الركيزة وتكوين ECM. كشف التحليل الكمي أن الكولاجين الرابع يدعم التمايز على كل من الركائز الناعمة والصلبة ، بينما يدعم الفيبرونيكتين فقط التمايز على الركائز الصلبة. تشير خرائط الحرارة التمثيلية إلى أن إجهاد الجر المستمر عند صلابة الركيزة المنخفضة على الكولاجين الرابع يعزز التمايز إلى خلايا القناة الصفراوية.

تم تأكيد هذه النتيجة من خلال القياس الكمي لمتوسط القيم التربيعية الجذرية لإجهاد الجر. قدم هذا الفيديو والبروتوكول المصاحب الخطوات الرئيسية لتصنيع الهلاميات المائية والمصفوفات لإجراء زراعة الخلايا على الركائز المصفوفة ولقياس تفاعلات الركيزة الخلوية باستخدام الفحص المجهري لقوة الجر. بعد التعرف على التقنيات ، يمكن إكمال كل تجربة في أقل من أسبوع إلى أسبوعين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

في الانكماش مع هذه الطريقة ، يجب استخدام مزارع الخلايا للتحقق من صحة ظروف المصفوفة عالية الدرجات باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل النوعي ، أو النشاف المناعي ، أو محاور البيولوجيا الميكانيكية ذات المقياس القياسي أو تقنيات البيولوجيا الجزيئية التكميلية الأخرى. يمكن تطبيق هذه المنصة متعددة الاستخدامات من أجل التحقيق في الإنتاجية العالية لوظائف الخلية في عدد كبير من سياقات الخلايا والأنسجة ، بما في ذلك تمايز الخلايا الجذعية وبيولوجيا الخلايا السرطانية.